本產(chǎn)品是大腸桿菌重組表達(dá)來源的噬菌體T7 RNA聚合酶，以含有T7啟動(dòng)子序列（5’-TAATACGACT CACTATAG*-3’）的雙鏈DNA為模板，以NTP為底物，合成與啟動(dòng)子下游的反向單鏈DNA互補(bǔ)的RNA。雙鏈線性平末端或5’突出末端DNA均可作為T7 RNA聚合酶的底物模板，因此線性質(zhì)粒、PCR產(chǎn)物均可用作體外合成RNA的模板。

注：G*為RNA轉(zhuǎn)錄的第一個(gè)堿基。

 

產(chǎn)品性質(zhì)

來源（Source）	重組E. coli
最適溫度（Optimum Temperature）	37℃
宿主核酸殘留（Host Nucleic acid Residue）	<10 fg/U
宿主蛋白殘留（Host Protein Residue）	<50 ppm
RNA酶殘留（RNase Residue）	陰性
儲(chǔ)存緩沖液（Storage Buffer）	50 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, 10 mM DTT, 100 mM NaCl, 0.1% Triton X-100，50%（v/v）甘油，pH7.9@25℃
活性單位定義（Unit Definition）	在 37℃、pH8.0 的條件下，1 h內(nèi)使 1 nmol 的 [3H] GMP 摻入酸不溶性沉淀物所需要的酶量定義為1個(gè)活性單位。

【注】：具體產(chǎn)品質(zhì)檢數(shù)據(jù)及更多指標(biāo)請查看批次質(zhì)檢報(bào)告。

 

產(chǎn)品組分

組分編號(hào)	組分名稱	產(chǎn)品編號(hào)/規(guī)格
		10626ES10 (10 KU)	10626ES60 (100 KU)
10626-A	T7 RNA polymerase (250 U/μL)	40 μL	400 μL
10626-B	10×Transcription Buffer	500 μL	1 mL×5

【注】：10×Transcription Buffer中含460 mM MgCl2和100 mM DTT，但不含有NTP，如需請購買本翌圣產(chǎn)品Cat#10133。

 

產(chǎn)品應(yīng)用

1. 單鏈 RNA合成（包括mRNA，siRNA，gRNA等各類RNA前體，以及同位素標(biāo)記或非同位素標(biāo)記的RNA探針）。

2. 以（Cap analog）為引物合成Capped mRNA。

 

運(yùn)輸和保存方法

干冰運(yùn)輸。-20℃保存，有效期一年。

 

注意事項(xiàng)

1. DNA模板的種類：推薦使用含T7啟動(dòng)子的線性化質(zhì)粒和PCR產(chǎn)物作為模板。

2. 轉(zhuǎn)錄模板的純度會(huì)顯著影響體外轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。在質(zhì)粒DNA抽提過程中殘留的RNase A會(huì)顯著影響轉(zhuǎn)錄RNA的質(zhì)量。通過酚-氯仿抽提的質(zhì)粒DNA為最佳模板；PCR產(chǎn)物建議采用膠回收純化后使用。

3. 在20 μL反應(yīng)體系中加入0.02 U熱穩(wěn)定無機(jī)焦磷酸酶可顯著提高轉(zhuǎn)錄產(chǎn)量。

4. 為了您的安全和健康，請穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。

 

應(yīng)用實(shí)例

按下列體系配制反應(yīng)體系

組分	體積（μL）	終濃度
10×Transcription Buffer (Mg2+ Plus)	2	1×
CTP/GTP/ATP/UTP (100 mM each)	0.4 each	2 mM each
T7 RNA Polymerase (250 U/μL)	0.8	-
RNase inhibitor (40 U/μL)	1	-
RNase free H2O	Up to 18	-
模板DNA	2 (100 ng-1μg)	-

注： 1) DNA模板需要最后加入。由于10×Buffer中含有亞精胺，亞精胺濃度過高會(huì)引起DNA模板沉淀。
2) Buffer和水建議放置到室溫，然后開始使用，反應(yīng)于室溫下配制，防止溫度低引起亞精胺沉淀高濃度DNA模板。
3) 若轉(zhuǎn)錄長度< 100 nt，模板投入量可增加至2 μg。
4) RNase inhibitor (40 U/μL)請購買翌圣產(chǎn)品Cat#10603。
5) 為了特定區(qū)域的有效轉(zhuǎn)錄，建議在其區(qū)域下游把模板DNA預(yù)先切成平端或5′突出末端。

2. 在37℃下反應(yīng)1-2 h（若轉(zhuǎn)錄長度≤ 100 nt，增加時(shí)間至4-8 h）。

3. 反應(yīng)結(jié)束后，使用2 U DNaseⅠ（無RNase）37℃、15 min去除DNA模板。

4. 轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物純化：體外轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物可選用RNA Cleaner磁珠進(jìn)行純化（翌圣產(chǎn)品Cat#12602），以去除蛋白、鹽離子和其他雜質(zhì)。也可以采用酚/氯仿純化法（具體操作步驟可聯(lián)系翌圣索?。?。

 

HB220325