Hieff NGS^® One-Step rRNA Removal Kit (Human，100-1,000 ng)利用靶向技術(shù)在cDNA合成過(guò)程中高特異性地抑制人總RNA中的核糖體RNA的逆轉(zhuǎn)錄，而不影響信使RNA (mRNA)、非編碼RNA以及環(huán)狀RNA等非靶RNA的cDNA合成，從而在一鏈cDNA合成過(guò)程中高特異性去除核糖體RNA。這種靶向去除技術(shù)相較于傳統(tǒng)的RNase H消化法具有耗時(shí)短 (3 min)、操作簡(jiǎn)單（一步操作）和非靶RNA保留完整等優(yōu)點(diǎn)，極大簡(jiǎn)化了操作流程和提高了建庫(kù)效率，可以與市面上各類一鏈cDNA合成試劑配套。該試劑盒對(duì)于完整和部分降解的總RNA（如FFPE RNA）均具有良好的rRNA去除效果。經(jīng)rRNA去除所獲得的cDNA樣本可用于高通量測(cè)序分析mRNA和非編碼RNA，可顯著提高測(cè)序結(jié)果中有效數(shù)據(jù)比例，也可用于其它c(diǎn)DNA下游應(yīng)用。提供的試劑已經(jīng)過(guò)嚴(yán)格的質(zhì)量控制和功能驗(yàn)證，最大程度上保證了rRNA去除的穩(wěn)定性和重復(fù)性。
 

適用范圍

適用于人來(lái)源的100-1000 ng 總RNA樣品；適用于完整或部分降解RNA（如FFPE RNA）樣品。

 

產(chǎn)品組分

產(chǎn)品組份	12258ES08	12258ES24	12258ES96
One-Step rRNA Removal Mix	8 μL	24 μL	96 μL

 

運(yùn)輸與保存方法

干冰運(yùn)輸，-20°C存放。效期兩年。

 

注意事項(xiàng)

一、關(guān)于操作

1. 請(qǐng)使用無(wú)RNase污染的耗材，并對(duì)實(shí)驗(yàn)區(qū)域定期進(jìn)行清理，推薦使用Thermo Fisher公司的RNAZap™ 高效核酸去除噴霧去除RNA酶污染。

2. RNA樣品應(yīng)不含基因組DNA污染，若樣品中有g(shù)DNA殘留，應(yīng)先進(jìn)行DNase I消化并純化后再用于本試劑盒。

3.若樣品體積較大，可先進(jìn)行濃縮。

4. 為了您的安全和健康，請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。

5. 本產(chǎn)品僅作科研用途！

二、自備材料

1. qRT-PCR質(zhì)檢rRNA去除效率：Hieff^® qPCR SYBR Green Master Mix(No Rox) (Cat#11201)或其他等效產(chǎn)品；

2. 其他材料：無(wú)菌超純水、低吸附槍頭、PCR管、PCR儀等。

 

使用方法

一、操作流程

 

圖1.使用快速去除核糖體RNA試劑盒+RNA建庫(kù)試劑盒進(jìn)行RNA建庫(kù)流程

二、操作步驟

方案1：在逆轉(zhuǎn)錄體系中去除rRNA。

1. 使用翌圣生物的Hifair^® Ⅱ 1st Strand cDNA Synthesis Kit (Cat#11119)進(jìn)行本試劑盒rRNA去除效率測(cè)試，其他逆轉(zhuǎn)錄試劑盒也可以用于本測(cè)試。

2. 逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系配制（20 μL體系）

RNA不片段化體系			RNA片段化體系
Total RNA	100-1000 ng		Total RNA	100-1000 ng
Random Primers N6 (50 μM)	1 μL		Random Primers N6 (50 μM)	1 μL
One-Step rRNA Removal Mix	1 μL		One-Step rRNA Removal Mix	1 μL
RNase free ddH2O	To 14 μL		5×Hifair® Ⅱ Buffer	4 μL
混勻后瞬離，按照下列反應(yīng)程序進(jìn)行反應(yīng)：			RNase free ddH2O	To 18 μL
75℃	1 min		混勻后瞬離，按照下列反應(yīng)程序進(jìn)行反應(yīng)：
50℃	2 min		94℃（片段化溫度和時(shí)間可根據(jù)需求自行調(diào)整）	5 min
4℃	Hold		75℃	1 min
			50℃	2 min
上述反應(yīng)體系	14 μL		4℃	Hold
5×Hifair® Ⅱ Buffer	4 μL
Hifair® Ⅱ Enzyme Mix	2 μL		上述反應(yīng)體系	18 μL
Total	20 μL		Hifair® Ⅱ Enzyme Mix	2 μL
混勻后瞬離，按照下列反應(yīng)程序進(jìn)行反應(yīng)：			Total	20 μL
25℃	5 min		混勻后瞬離，按照下列反應(yīng)程序進(jìn)行反應(yīng)：
42℃	30 min		25℃	5 min
85℃	5 min		42℃	15 min
			85℃	5 min

 

3. qPCR檢測(cè)rRNA去除效果。

 

圖2. qPCR驗(yàn)證一步rRNA快速去除試劑盒的去除效果

方案2：在RNA NGS文庫(kù)構(gòu)建中去除rRNA。

1. 使用翌圣生物的Hieff NGS^® Dual-mode RNA Library Prep Kit (Cat#12252 for Illumina, Cat#13333for MGI)進(jìn)行本試劑盒rRNA去除效率測(cè)試。

RNA片段化
組份	體積
Total RNA	100-1000 ng
2×Frag/Prime Buffer	8.5 μL
One-Step rRNA Removal Mix	1 μL
DEPC H2O	to 17 μL
混勻后瞬離，按照下列反應(yīng)程序進(jìn)行反應(yīng)：
溫度	時(shí)間
94℃（片段化溫度和時(shí)間可根據(jù)需求自行調(diào)整）	5 min
75℃	1 min
50℃	2 min
4℃	Hold
組份	體積
上述反應(yīng)體系	17 μL
Strand Specificity Reagent	6 μL
1st Strand Enzyme Mix	2 μL
Total	25 μL
混勻后瞬離，按照下列反應(yīng)程序進(jìn)行反應(yīng)：
溫度	時(shí)間
25℃	10 min
42℃	15 min
70℃	15 min
接Step 2第二鏈cDNA的合成/末端修復(fù)/加A

 

 

 

圖3. 二代測(cè)序驗(yàn)證一步rRNA快速去除試劑盒的去除效果

 

 

2. 使用New England Biolabs的NEBNext Ultra II Directional RNA Library Prep Kit for Illumina (Cat#E7760)聯(lián)合本試劑盒進(jìn)行rRNA去除方案。
 

RNA片段化
組份	體積
Total RNA	100-1,000 ng
First Strand Synthesis Reaction Buffer (5×)	4 μL
Random Primers	1 μL
One-Step rRNA Removal Mix	1 μL
DEPC H2O	to 10 μL
混勻后瞬離，按照下列反應(yīng)程序進(jìn)行反應(yīng)：
溫度	時(shí)間
94℃（片段化溫度和時(shí)間可根據(jù)需求自行調(diào)整）	5 min
75℃	1 min
50℃	2 min
4℃	Hold
接下游一鏈合成體系

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