產(chǎn)品說明書
FAQ
COA
已發(fā)表文獻
產(chǎn)品名稱
|
產(chǎn)品名稱 |
產(chǎn)品編號 |
規(guī)格 |
價格（元） |
促銷價（元） |
|
Hieff UNICON® Power qPCR SYBR Green Master Mix(抗體法，High Rox)
|
11197ES03 |
1 ml |
383.00 |
223.00 |
|
11197ES08 |
5×1ml |
1653.00 |
663.00 |
|
|
11197ES50 |
10×5 ml |
12533.00 |
6613.00 |
|
|
11197ES60 |
20×5 ml |
19833.00 |
12563.00 |
產(chǎn)品描述
本產(chǎn)品是2×實時定量PCR擴增的預混合溶液。具有高特異性和高檢出率的特點。采用的抗體法熱啟動Taq DNA聚合酶，在預變性溫度（95℃）加熱30 sec，急速釋放出Taq DNA Polymerase活性。UNICON® Taq抗體可以有效抑制樣品準備過程中引物退火導致的非特異性擴增。同時配方額外添加了有效抑制非特異性PCR擴增的組分和均衡不同GC含量（30%-70%）基因擴增的促進因子。使定量PCR結(jié)果可以在寬廣范圍內(nèi)更加真實有效。
預混液含有所有PCR擴增的組分。使用時，僅需在擴增體系中加入模板和引物即可進行實時熒光定量PCR，大大簡化操作過程，降低污染幾率。
運輸與保存方式
冰袋運輸。-20℃避光儲存，有效期18個月。
本品避免反復凍融。產(chǎn)品中含有熒光染料SYBR Green I，保存或配制反應體系時需避免強光照射。
注意事項
1. 推薦使用本公司cDNA合成試劑盒（貨號：11123ES），以有效去除RNA樣品中殘留的基因組。
2. 產(chǎn)品解凍后如果發(fā)現(xiàn)不溶物，請上下顛倒混勻至溶液澄清，不影響試劑性能。
3. 為了您的安全和健康，請穿實驗服并佩戴一次性手套操作。
4. 本產(chǎn)品僅作科研用途！
反應體系（推薦冰上配制）
|
組分 |
體積（μl） |
體積（μl） |
終濃度 |
|
Hieff UNICON® Power qPCR SYBR Green Master Mix (抗體法，High Rox) |
25 |
10 |
1× |
|
Forward Primer (10 μM) |
1 |
0.4 |
0.2 μM |
|
Reverse Primer (10 μM) |
1 |
0.4 |
0.2 μM |
|
模板DNA |
X |
X |
- |
|
無菌超純水 |
to 50 |
to 20 |
- |
【注】：使用前務必充分混勻，避免劇烈震蕩產(chǎn)生過多氣泡。
a) 引物濃度：通常引物終濃度為0.2 μM，也可以根據(jù)情況在0.1-1.0 μM之間進行調(diào)整。
b) 模板濃度：如模板類型為未稀釋cDNA原液，使用體積不應超過qPCR反應總體積的1/10。
c) 模板稀釋：cDNA原液建議5-10倍稀釋，最佳模板加入量以擴增得到的CT值在20-30個循環(huán)為好。
d) 反應體系：推薦使用20 μl或50 μl，以保證目的基因擴增的有效性和重復性。
e) 體系配制：請于超凈工作臺內(nèi)配制，并使用無核酸酶殘留的槍頭、反應管；推薦使用帶濾芯的槍頭。避免交叉污染和氣溶膠污染。
|
擴增程序（兩步法） |
擴增程序（三步法） |
||||||
|
循環(huán)步驟 |
溫度 |
時間 |
循環(huán)數(shù) |
循環(huán)步驟 |
溫度 |
時間 |
循環(huán)數(shù) |
|
預變性 |
95℃ |
30 sec |
1 |
預變性 |
95℃ |
30 sec |
1 |
|
變性 |
95℃ |
10 sec |
40 |
變性 |
95℃ |
10 sec |
40 |
|
退火/延伸 |
60℃ |
30 sec★ |
退火 |
55-60℃ |
20 sec |
||
|
熔解曲線階段 |
儀器默認設置 |
1 |
延伸 |
72℃ |
20 sec★ |
||
|
熔解曲線階段 |
儀器默認設置 |
1 |
|||||
【注】：高特異性可選擇兩步法，高效率擴增可選擇三步法。
a) 預變性時間：本反應條件適合大多數(shù)基因擴增，如果遇到含有復雜結(jié)構(gòu)的基因可適當增加預變性時間至3-5 min。
b) 退火溫度和時間：請根據(jù)引物和目的基因的長度進行調(diào)整。
c) 熒光信號采集（★）：請按照儀器使用說明書要求進行實驗程序設置，幾種常見儀器的時間設定如下:
30 sec以上：Applied Biosystems: StepOne, StepOne Plus, 7500 Fast；Roche Applied Science: LightCycler 480；Bio-Rad: CFX96
31 sec以上：Applied Biosystems: 7300
34 sec以上：Applied Biosystems: 7500
d) 熔解曲線：通常情況下可以使用儀器默認程序。
結(jié)果分析
定量實驗至少需要三個生物學重復。反應結(jié)束后需要確認擴增曲線及熔解曲線。
1) 擴增曲線：標準擴增曲線為S型。
Ct值落在20-30之間時，定量分析最準確；
Ct值小于10，需要將稀釋模板后，重新進行實驗；
Ct值介于30-35之間時，需要提高模板濃度，或者增大反應體系的體積，以提高擴增效率，保證結(jié)果分析的準確性；
Ct值大于35時，檢測結(jié)果無法定量分析基因的表達量，但可用于定性分析。
2) 熔解曲線：
熔解曲線單峰，表明反應特異性好可以進行定量結(jié)果分析；若熔解曲線出現(xiàn)雙峰或者多峰，則不能進行定量分析。
熔解曲線出現(xiàn)雙峰，需要通過DNA瓊脂糖凝膠電泳判斷非目標峰是引物二聚體還是非特異性擴增。
如果是引物二聚體，建議降低引物濃度，或者重新設計擴增效率高的引物。
如果是非特異性擴增，請?zhí)岣咄嘶饻囟?，或者重新設計更高特異性的引物。
引物設計指南
1）推薦引物長度25 bp左右。擴增產(chǎn)物長度150 bp為佳，不要低于100 bp，可以在100 bp-300 bp內(nèi)選擇。2）正向引物和反向引物的Tm值相差不宜超過2℃。引物Tm值60℃-65℃為佳。
3）引物堿基分布要均勻，避免出現(xiàn)連續(xù)的4個相同堿基，GC含量控制在50%左右。3’端最后一個堿基最好為G或C。
4）引物內(nèi)部或者正反兩條引物間最好避免出現(xiàn)有3個堿基以上的互補序列。
5）引物特異性需要用NCBI BLAST程序進行核對。避免引物3’端有2個堿基以上的非特異性互補。
6）設計完成的引物需要進行擴增效率的檢測，只有具備相同擴增效率的引物才可用于定量比較分析。
適用機型
Applied Biosystems: 5700, 7000, 7300, 7700, 7900HT FAST, StepOne, StepOne Plus
相關產(chǎn)品
|
產(chǎn)品名稱 |
貨號 |
規(guī)格 |
|
Hifair® II 1st Strand cDNA Synthesis Kit (gDNA digester plus) |
11121ES60 |
100 T |
|
Hifair® II 1st Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR(gDNA digester plus) |
11123ES60 |
100 T |
|
11201ES08 |
5 mL |
|
|
11202ES08 |
5 mL |
|
|
11203ES08 |
5 mL |
|
|
Hieff UNICON® Power qPCR SYBR Green Master Mix ( 抗體法，No Rox) |
11195ES08 |
5 mL |
|
Hieff UNICON® Power qPCR SYBR Green Master Mix ( 抗體法，Low Rox) |
11196ES08 |
5 mL |
|
Hieff UNICON® Power qPCR SYBR Green Master Mix ( 抗體法，High Rox) |
11197ES08 |
5 mL |
|
11198ES08 |
5 mL |
|
|
11199ES08 |
5 mL |
|
|
11200ES08 |
5 mL |
HB210824
