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Hieff UNICON^? qPCR SYBR Green Master Mix(抗體法,Low Rox)

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產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)

FAQ

COA

已發(fā)表文獻(xiàn)

產(chǎn)品簡(jiǎn)介

本產(chǎn)品是2×實(shí)時(shí)定量PCR擴(kuò)增的預(yù)混合溶液。采用的抗體法熱啟動(dòng)DNA聚合酶（貨號(hào)：10113ES），在預(yù)變性溫度（95℃）加熱30sec，UNICON® Taq抗體失活，釋放出Taq DNA Polymerase活性?？贵w法熱啟動(dòng)Taq酶可以有效抑制引物非特異性退火導(dǎo)致的擴(kuò)增。同時(shí)，配方優(yōu)化了有效抑制非特異性PCR擴(kuò)增的因子和提升PCR反應(yīng)擴(kuò)增效率的因子，適合低濃度模板的擴(kuò)增，使定量PCR可以在寬廣的定量區(qū)域內(nèi)獲得良好的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

Mix中含有Hieff® Taq DNA Polymerase、UNICON® Taq抗體、SYBR Green I、dNTPs、Mg²⁺及Low Rox。使用時(shí)，僅需在擴(kuò)增體系中加入模板和引物即可進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR，大大簡(jiǎn)化操作過(guò)程，降低污染幾率。

產(chǎn)品信息

貨號(hào)	11199ES03 / 11199ES08 / 11199ES25 / 11199ES50 / 11199ES60
規(guī)格	1 mL / 5×1 mL / 5×5 mL / 10×5 mL / 20×5 mL

儲(chǔ)存條件

-25~-15℃避光保存，有效期18個(gè)月。本品避免反復(fù)凍融。產(chǎn)品中含有熒光染料SYBR Green I，保存或配制反應(yīng)體系時(shí)需避免強(qiáng)光照射。

使用說(shuō)明

反應(yīng)體系（推薦冰上配制）

組分	體積 (μL)****	體積 (μL)	終濃度
Hieff UNICON® qPCR SYBR Green Master Mix (抗體法，Low Rox)*	25	10	1×
Forward Primer (10 μM)**	1	0.4	0.2 μM
Reverse Primer (10 μM)**	1	0.4	0.2 μM
模板DNA***	X	X	-
RNase Free H₂O	to 50	to 20	-

*使用前務(wù)必充分混勻，避免劇烈震蕩產(chǎn)生過(guò)多氣泡。

**通常引物終濃度為0.2 μM，也可以根據(jù)情況在0.1-1.0 μM之間進(jìn)行調(diào)整。

***如模板類型為未稀釋cDNA原液，使用體積不應(yīng)超過(guò)qPCR反應(yīng)總體積的1/10。cDNA原液建議5-10倍稀釋，最佳模板加入量以擴(kuò)增得到的CT值在20-30個(gè)循環(huán)為好。

****推薦使用20 μL或50 μL總體積，以保證目的基因擴(kuò)增的有效性和重復(fù)性。

擴(kuò)增程序*

兩步法

循環(huán)步驟	溫度	時(shí)間	循環(huán)數(shù)
預(yù)變性**	95℃	30 sec	1
變性	95℃	10 sec	40
退火/延伸***	60℃	30 sec****	40
熔解曲線階段*****	儀器默認(rèn)設(shè)置		1

2）三步法

循環(huán)步驟	溫度	時(shí)間	循環(huán)數(shù)
預(yù)變性**	95℃	30 sec	1
變性	95℃	10 sec	40
退火***	55-60℃	20 sec
延伸	72℃	20 sec****
熔解曲線階段*****	儀器默認(rèn)設(shè)置		1

*高特異性可選擇兩步法，高效率擴(kuò)增可選擇三步法。

**預(yù)變性時(shí)間可根據(jù)不同模板和引物的具體情況適當(dāng)增加至3-5 min。

***退火溫度和時(shí)間請(qǐng)根據(jù)引物和目的基因的長(zhǎng)度進(jìn)行調(diào)整。

****熒光信號(hào)采集請(qǐng)按照儀器使用說(shuō)明書(shū)要求進(jìn)行實(shí)驗(yàn)程序設(shè)置，幾種常見(jiàn)儀器的時(shí)間設(shè)定如下：

30sec以上：Applied Biosystems: StepOne, StepOne Plus, 7500 Fast；Roche Applied Science: LightCycler 480；Bio-Rad: CFX96

31sec以上：Applied Biosystems: 7300

34sec以上：Applied Biosystems: 7500

*****熔解曲線通常情況下可以使用儀器默認(rèn)程序。

結(jié)果分析

定量實(shí)驗(yàn)至少需要三個(gè)生物學(xué)重復(fù)。反應(yīng)結(jié)束后需要確認(rèn)擴(kuò)增曲線及熔解曲線。

1）擴(kuò)增曲線

Ct值落在20-30之間時(shí)，定量分析最準(zhǔn)確；
Ct值小于10，需要將稀釋模板后，重新進(jìn)行實(shí)驗(yàn)；
Ct值介于30-35之間時(shí)，需要提高模板濃度，或增大反應(yīng)體系的體積，以提高擴(kuò)增效率，保證結(jié)果分析的準(zhǔn)確性；
Ct值大于35時(shí)，檢測(cè)結(jié)果無(wú)法定量分析基因的表達(dá)量，但可用于定性分析。

2）熔解曲線

a. 熔解曲線單峰，表明反應(yīng)特異性好可以進(jìn)行定量結(jié)果分析；若熔解曲線出現(xiàn)雙峰或者多峰，則不能進(jìn)行定量分析。

b. 熔解曲線出現(xiàn)雙峰，需要通過(guò)DNA瓊脂糖凝膠電泳判斷非目標(biāo)峰是引物二聚體還是非特異性擴(kuò)增。

c. 如果是引物二聚體，建議降低引物濃度，或者重新設(shè)計(jì)擴(kuò)增效率高的引物。

d. 如果是非特異性擴(kuò)增，請(qǐng)?zhí)岣咄嘶饻囟?，或者重新設(shè)計(jì)更高特異性的引物。

引物設(shè)計(jì)指南

1）推薦引物長(zhǎng)度25 bp左右。擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度150 bp為佳，可以在100 bp-300 bp內(nèi)選擇。

2）正向引物和反向引物的Tm值相差不宜超過(guò)2℃。引物Tm值60℃-65℃為佳。

3) 引物堿基分布要均勻，避免出現(xiàn)連續(xù)的4個(gè)相同堿基，GC含量控制在50%左右。3’端最后一個(gè)堿基最好為G或C。

4) 引物內(nèi)部或者正反兩條引物間最好避免出現(xiàn)有3個(gè)堿基以上的互補(bǔ)序列。

5) 引物特異性需要用NCBI BLAST程序進(jìn)行核對(duì)。避免引物3’端有2個(gè)堿基以上的非特異性互補(bǔ)。

6) 設(shè)計(jì)完成的引物需要進(jìn)行擴(kuò)增效率的檢測(cè)，只有具備相同擴(kuò)增效率的引物才可用于定量比較分析。

5. 適用機(jī)型

Applied Biosystems: 7500, 7500 Fast, ViiA7, QuantStudio Dx, QuantStudio 3 and 5, QuantStudio 6,7,12k Flex;

Stratagene: MX3000P, MX3005P, MX4000.

注意事項(xiàng)

推薦使用本公司cDNA合成試劑盒（Cat#11141），以有效去除RNA樣品中殘留的基因組。
解凍后Master Mix可能出現(xiàn)絮狀物質(zhì)，4℃放置并上下顛倒混勻至溶液澄清，不影響試劑性能。
為了您的安全和健康，請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并佩戴一次性手套操作。
本產(chǎn)品僅作科研用途。

Ver.CN20231128

Q1:模板用量X 是多少？常用的量是多少？

A:(1)X 表示模板 DNA 量需要實(shí)驗(yàn)者在首次實(shí)驗(yàn)時(shí)進(jìn)行摸索。首先對(duì)模板DNA 進(jìn)行稀釋（一般推薦 5-10 倍），然后模板量梯度上樣，選擇 CT 值落在 20-30 之間的最佳上樣量。

(2)常用的量是逆轉(zhuǎn)錄 500-1000ng 總RNA，稀釋 10 倍取 1μL cDNA 進(jìn)行qPCR 實(shí)驗(yàn)。

Q2:qPCR 實(shí)驗(yàn)結(jié)果的有效性？為什么建議Ct 值要大于 15？

A:(1)有效性要滿足三個(gè)條件：（1）標(biāo)準(zhǔn)曲線：擴(kuò)增效率范圍:90-110%，對(duì)應(yīng)斜率為-3--3.5。R2＞0.98。 (擴(kuò)增效率=10-1/斜率-1)，當(dāng)斜率=-3.32 時(shí)，擴(kuò)增效率=100%。
（2）擴(kuò)增曲線：S 型曲線，且 Ct 值在 15－35 之間，陰性對(duì)照 Ct＞35 或無(wú)Ct 值。
（3）熔解曲線：為單一峰。(2)3-15 個(gè)循環(huán)的熒光值標(biāo)準(zhǔn)差的 10 倍是熒光閾值，Ct 值太小了會(huì)影響曲線。

Q3:Rox 的作用？

A:ROX 是一種參比染料，其作用是標(biāo)準(zhǔn)化熒光定量反應(yīng)中的非PCR 震蕩，校正加樣誤差或者是孔與孔之間的誤差，提供一個(gè)穩(wěn)定的基線。

Q4:為什么擴(kuò)增曲線不穩(wěn)定（擴(kuò)增曲線平臺(tái)期鋸齒狀）？
A:可能原因：a）RNA 純度低，體系中存在較多雜質(zhì)；推薦參數(shù)：OD260/OD280=1.8-2.0， OD260/OD230＞2.0。隨著 qPCR 反應(yīng)的進(jìn)行，阻礙反應(yīng)的因素不斷增加，若 RNA 純度低，雜質(zhì)多，會(huì)進(jìn)一步影響儀器平臺(tái)期的算法，導(dǎo)致出現(xiàn)鋸齒狀。

b）儀器長(zhǎng)時(shí)間未做校準(zhǔn)。儀器未校準(zhǔn)會(huì)使儀器算法錯(cuò)誤，導(dǎo)致各種異常結(jié)果。

解決方案：a）先梯度加大模板稀釋倍數(shù)看優(yōu)化效果。若效果仍不好建議新制備高純度RNA 重新實(shí)驗(yàn)。

b）定期（一般 1 年）進(jìn)行儀器校準(zhǔn)保養(yǎng)。

Q5:為什么擴(kuò)增曲線無(wú)法達(dá)到平臺(tái)期？

A:可能原因：a）模板量太低（CT 值 35 左右）。推薦 Ct 值：15＜Ct＜30。原因：Ct 值太大（如 Ct＞30），剛進(jìn)入指數(shù)擴(kuò)增期幾個(gè)循環(huán)就停止了反應(yīng)，故無(wú)法到達(dá)平臺(tái)期。
b）循環(huán)次數(shù)太少（30 cycles）；循環(huán)次數(shù)過(guò)少（如 35）導(dǎo)致剛進(jìn)入指數(shù)擴(kuò)增期幾個(gè)循環(huán)就停止了反應(yīng)，故無(wú)法到達(dá)平臺(tái)期。
c）試劑擴(kuò)增效率低（CT 小，但無(wú)法達(dá)到平臺(tái)期，曲線比較“趴”）。
解決方案：a）提高模板量；參考 Q1 的優(yōu)化方法。

b）提高循環(huán)次數(shù)；推薦循環(huán)數(shù)：一般 40。低豐度基因可設(shè) 45。
c）做標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定擴(kuò)增效率，若確實(shí)偏低，則換試劑。

d）增加 Mg2+濃度（會(huì)增加非特異擴(kuò)增）

Q6:為什么出現(xiàn)雙峰，并且較低峰 Tm 在 80℃之前？

A:較低峰 Tm 在 80℃之前可能原因：存在引物二聚體（一般mRNA 反轉(zhuǎn)錄后定量，產(chǎn)物在 100-150bp 左右，峰對(duì)應(yīng) Tm 值為 80-90℃。若有引物二聚體存在，引物二聚體大小只有幾十bp，峰對(duì)應(yīng) Tm 值在 70-80℃之間。故會(huì)在 80℃以前出現(xiàn)一個(gè)峰， 80℃以后出現(xiàn)一個(gè)峰），模板濃度過(guò)低或引物濃度過(guò)高。

解決方案：a）適當(dāng)提高退火溫度； b）提高模板量，降低引物濃度； c）重新設(shè)計(jì)引物。

Q7:為什么出現(xiàn)雙峰，雙峰 Tm 都在 80℃以前？

A:雙峰Tm 都在 80℃以前的可能原因：做 MicroRNA 定量時(shí)存在引物二聚體。Micro RNA 反轉(zhuǎn)錄后定量，產(chǎn)物在 80-90bp 左右，峰對(duì)應(yīng)Tm 值為 70-80℃，若有引物二聚體存在，引物二聚體大小只有幾十 bp，峰對(duì)應(yīng) Tm 值也在 70-80℃之間。故會(huì)在 80℃ 以前出現(xiàn)雙峰。

優(yōu)化方法：提高退火溫度、降低引物濃度或重新設(shè)計(jì)引物等方式優(yōu)化。Q8:為什么出現(xiàn)雙峰，并且雙峰Tm 都在 80℃以后？

A:可能原因：a）引物特異性過(guò)差導(dǎo)致非特異性產(chǎn)物擴(kuò)增。
b）交叉污染。

c）gDNA 污染，可通過(guò) NRC 進(jìn)行確認(rèn)。

解決方案：a）Blast 檢查引物特異性，差則重新設(shè)計(jì)引物。
b）超凈臺(tái)中操作，注意更換 Tip 頭，避免交叉污染。

c）通過(guò) NRC 陰性對(duì)照進(jìn)行確認(rèn)，若有，需重新制備模板。

Q9:為什么是單峰，但 Tm 在 80℃之前？

A:可能原因：擴(kuò)增產(chǎn)物是完全的引物二聚體，可能是未加模板。

注：若 microRNA，則結(jié)果正常（做 microRNA 定量時(shí)存在引物二聚體。micro RNA 反轉(zhuǎn)錄后定量，產(chǎn)物在 80-90bp 左右，峰對(duì)應(yīng) Tm 值為 70-80℃，若有引物二聚體存在，引物二聚體大小只有幾十bp，峰對(duì)應(yīng) Tm 值也在 70-80℃之間。故會(huì)在 80℃以前出現(xiàn)雙峰）。

解決方案：進(jìn)行高分辨率瓊脂糖電泳，檢測(cè)有無(wú)目的條帶，以確定模板是否加入。優(yōu)化方法：新配制無(wú)誤的反應(yīng)體系，重新實(shí)驗(yàn)。

Q10:為什么是單峰，但峰不尖銳？

A:可能原因：存在大小相近的非特異性擴(kuò)增

解決方案：a）溫度跨度不高于 7℃，視為可用結(jié)果（即 Tm 值跨度＜7℃可認(rèn)為是同一種產(chǎn)物）；

b）進(jìn)行高濃度瓊脂糖電泳（高分辨率），確認(rèn)是否為單一條帶。

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400-6111-883

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