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            首頁 / 干細胞/類器官 / 產(chǎn)品應(yīng)用詳情

            人肺類器官培養(yǎng)手冊

                新冠病毒在病變的晚期大面積感染肺組織,可能會對肺功能造成嚴(yán)重的損害在過去三年中,人類干細胞衍生的類器官已經(jīng)成為了新冠研究的有利工具。

             人肺類器官(human lung organoid, hLOs)擁有類似支氣管和肺泡的結(jié)構(gòu),與人肺部組織結(jié)構(gòu)功能相似,培養(yǎng)過程復(fù)雜。研究人員利用小分子化合物和細胞因子誘導(dǎo)干細胞生成了內(nèi)胚層,再讓內(nèi)胚層形成三維組織,得到了類似胚胎中早期肺的組織,進一步使其發(fā)育成為肺部組織。

            人肺類器官培養(yǎng)方案有很多種,接下來,我們根據(jù)Han和Alyssa J Miller文章總結(jié)了人類多能干細胞(hPSC)形成人肺類器官和芽尖祖細胞類器官的大致過程[1][2]。

             

            圖1 Alyssa J Miller等的hPSC形成人肺類器官和芽尖祖細胞類器官的過程[2]

             

            培養(yǎng)方案

            01

             hPSC定向分化為內(nèi)胚層

                     hPSCs用Accutase (40506ES)處理并接種到低吸附的6孔板上,重懸于含有10 μM Y-27632 (53006ES)、0.5 ng/mL human BMP4 (92053ES)、2.5 ng/mL human bFGF (91330ES)、100 ng/mL human Activin A (91702ES)的無血清分化培養(yǎng)基中培養(yǎng)3-4天。

            02

             誘導(dǎo)形成前腸球體

                     為誘導(dǎo)前腸球體,更換培養(yǎng)基為前腸分化培養(yǎng)基:DMEM/F12培養(yǎng)基中添加1× N-2 (60706ES)、1× B27 (60704ES)、10 mM HEPES (60117ES)、1× L-谷氨酰胺(60314ES)、10 µM SB431542 (53004ES)、200 ng/mL human Noggin (92528ES)、1 µM SAG (53257ES)、500 ng/mL human FGF4 (91303ES)和2 µM CHIR99021 (53003ES),培養(yǎng)5天。

                     然后在不破壞單層細胞的情況下收集漂浮的球體,離心后轉(zhuǎn)移至新的離心管中,接種至含有Matrigel膠的平板中,37°C靜置。

             

            2 前腸球體的明場圖片[2]

             

            03

             誘導(dǎo)人肺類器官和芽尖祖類細胞器官

             

            3.1 誘導(dǎo)人肺類器官

                     向前腸球體中加入人肺類器官誘導(dǎo)培養(yǎng)基:DMEM/F12培養(yǎng)基中添加1× N-2 (60706ES)、1× B27 (60704ES)、1% FBS、10 mM HEPES (60117ES)、1× L-谷氨酰胺(60314ES)、500 ng/mL human FGF10 (91306ES)進行培養(yǎng),每兩周換液。

            大約需要50天可以產(chǎn)生人肺類器官,并且具有氣道樣上皮細胞,周圍環(huán)繞著間充質(zhì)細胞和表達肺泡細胞型標(biāo)記物的上皮細胞的彌散網(wǎng)絡(luò)。

             

            3 人肺類器官預(yù)期生長模式的明場圖像[2]

             

            3.2 誘導(dǎo)芽尖祖細胞類器官

                     向前腸球體中加入人肺類器官誘導(dǎo)培養(yǎng)基:DMEM/F12培養(yǎng)基中添加1× N-2 (60706ES)、1× B27 (60704ES)、10 mM HEPES  (60117ES)、1× L-谷氨酰胺(60314ES)、10 ng/mL human FGF7 (91304ES)、0.5% BSA (36102ES)、50 µg/mL抗壞血酸(53614ES)、3 µM CHIR99021 (53003ES)、50 nM ATRA (53001ES)和0.4 µM monothio-glycerol,進行培養(yǎng),每2-3天換液,會生成芽尖祖細胞類器官。

                     培養(yǎng)22天后,芽尖祖細胞類器官含有高度富集和增殖的、轉(zhuǎn)錄類似于人類胎兒芽尖祖細胞的SOX2+ - SOX9+ ID2+ NKX2.1+種群細胞。

             

            4 芽尖祖細胞類器官生長模式的明場圖像[2]

             

            相關(guān)產(chǎn)品

            產(chǎn)品名稱

            產(chǎn)品編號

            規(guī)格

            簡介

            Y-27632

            53006ES

            1 mg/5 mg/10 mg

            ROCK抑制劑

            SB431542

            53004ES

            5 mg/10 mg/50 mg

            Src家族激酶抑制劑,TGF-β信號通路抑制劑

            CHIR99021

            53003ES

            2 mg/5 mg/10 mg

            GSK-3α/β抑制劑

            Smoothened Agonist (SAG)

            53257ES

            2 mg/5 mg/10 mg

            Smo受體激動劑

            L-Ascorbic acid L-抗壞血酸

            53614ES

            1 g/5 g

            維生素C,抗氧化劑

            Retinoic acid(維甲酸,維A酸)

            53001ES

            100 mg/500 mg/1 g

            誘導(dǎo)細胞分化

            Accutase™ 細胞消化液

            40506ES

            100 mL

            細胞消化液

            human BMP4

            92053ES

            10 μg/100 μg/500 μg

            重組蛋白

            human bFGF

            91330ES

            10 μg/100 μg/500 μg

            重組蛋白

            human Activin A

            91702ES

            10 μg/100 μg/500 μg

            重組蛋白

            human Noggin

            92528ES

            5 μg/100 μg/500 μg

            重組蛋白

            human FGF4 

            91303ES

            5 μg/100 μg/500 μg

            重組蛋白

            human FGF10

            91306ES

            5 μg/100 μg/500 μg

            重組蛋白

            human FGF7

            91304ES

            10 μg/100 μg/500 μg

            重組蛋白

            N-2 supplement,serum free,100X

            60706ES

            5 mL

            用于細胞和組織體外培養(yǎng)

            HEPES溶液(1 M),細胞培養(yǎng)級

            60117ES

            100 mL

            化學(xué)緩沖劑

            L-谷氨酰胺

            60314ES

            100 g

            氨基酸

            BSA牛血清白蛋白,診斷級別

            36102ES

            25 g/100 g/500 g/1 kg

            用于細胞培養(yǎng)

            50× B-27無血清添加劑,去除維生素A

            60704ES

            10 mL

            無血清添加劑

            Ceturegel® Matrix for Organoid culture,Phenol Red-Free,LDEV-Free 基質(zhì)膠

            40191ES08/10 5mL/10mL 類器官

             

            參考文獻

            [1] Han Y, et al. Identification of SARS-CoV-2 inhibitors using lung and colonic organoids. Nature. 2021 Jan;589(7841):270-275.

            [2] Miller AJ, et al. Generation of lung organoids from human pluripotent stem cells in vitro. Nat Protoc. 2019 Feb;14(2):518-540.

             

             

            400-6111-883