讓實驗小白也可以做出好的qPCR結(jié)果
qPCR實驗易做，但數(shù)據(jù)分析并非想象中的那么容易！數(shù)據(jù)分析的好與壞，極大程度上依賴于qPCR原始結(jié)果的質(zhì)量。
qPCR結(jié)果的評價指標(biāo)
•溶解曲線，是qPCR結(jié)果判定的第一要素。它的作用是判定目的基因是否得到擴(kuò)增。理論上，當(dāng)反應(yīng)體系中僅是目標(biāo)基因的擴(kuò)增，才是有效擴(kuò)增。
•標(biāo)準(zhǔn)曲線，是qPCR結(jié)果判定的金標(biāo)準(zhǔn)。（在溶解曲線判定為特異性擴(kuò)增后）它的作用是測定引物的擴(kuò)增效率及試劑的檢測上下限。根據(jù)文章發(fā)表對于qPCR數(shù)據(jù)的要求，擴(kuò)增效率應(yīng)在90-110%。
•擴(kuò)增曲線，是直接生成qPCR定量的數(shù)據(jù)，即Ct值。從試劑對比角度而言，Ct值大小常被用于判定試劑擴(kuò)增效率的高低。
產(chǎn)品描述
Hieff Unicon® Power qPCR SYBR Green Master Mix，這是一款旨在解決諸多qPCR實驗常見疑難問題的qPCR試劑：
•它減少了大量引物驗證的預(yù)實驗工作，是一款具備強引物兼容性的Mix，
•它明確了qPCR溶解曲線峰型的標(biāo)準(zhǔn)——“單峰的形狀”，對于“什么溶解曲線是好的溶解曲線”的解讀具有參考意義，
•它讓時間不再碎片化，1次體系配制，24 h時間自由支配
產(chǎn)品特點
□引物兼容性強：針對遵循qPCR引物設(shè)計原則設(shè)計的引物，使用Hieff Unicon® Power 引物使用率可達(dá)97%；
□模板加入量靈活：可檢測10-107個拷貝個數(shù)的基因片段；
□特異性高：標(biāo)準(zhǔn)溶解曲線峰型，有效避免“胖”峰、“多”峰的出現(xiàn)；
□穩(wěn)定性強：產(chǎn)品經(jīng)50次反復(fù)凍融驗證，擴(kuò)增性能無變化；
□操作靈活：配制好的qPCR反應(yīng)液4℃保存24 h，擴(kuò)增性能無變化；
□擴(kuò)增時間短：每個擴(kuò)增循環(huán)中，退火、延伸一步完成，用時15 sec。
產(chǎn)品性能展示
1. 超高特異性，簡化了qPCR實驗的引物設(shè)計
圖1. Hieff® Unicon Power預(yù)混液實現(xiàn)了引物的高特異性擴(kuò)增
以293T細(xì)胞cDNA為模板，利用Prime5軟件設(shè)計200bp擴(kuò)增長度的片段（GC含量：30%-70%）的引物共1000對，隨機挑選88對，使用Hieff Unicon® Power預(yù)混液測定引物的擴(kuò)增特異性。通過溶解曲線分析，88個檢測片段中有86個（97.7%）目標(biāo)片段有效擴(kuò)增，說明Hieff Unicon® Power預(yù)混液引物兼容性強，具備高特異性擴(kuò)增、高檢出率的特點。
2. 超高特異性，保證了Ct值的真實性
圖2. Hieff® Unicon Power預(yù)混液擴(kuò)增高度特異，Ct值結(jié)果可信度高
以1 ng人gDNA為模板，使用不同品牌預(yù)混液按照標(biāo)準(zhǔn)擴(kuò)增程序，擴(kuò)增5個目的基因片段，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分析擴(kuò)增產(chǎn)物情況。結(jié)果顯示Hieff Unicon® Power預(yù)混液針對不同靶標(biāo)基因均可以高特異性擴(kuò)增，得到可信的靶標(biāo)片段Ct值。
3. 檢測范圍寬廣，模板添加不再糾結(jié)
圖3. Hieff® Unicon Power預(yù)混液可有效檢測6個數(shù)量級范圍的模板量
以質(zhì)粒DNA為模板，10倍梯度稀釋（107-101 拷貝/μl），擴(kuò)增IL23R基因。結(jié)果顯示Hieff Unicon® Power預(yù)混液擴(kuò)增特異，線性相關(guān)性高，可在寬廣的定量區(qū)域內(nèi)獲得良好的線性關(guān)系。
4. 良好的穩(wěn)定性，讓體系配制更加靈活：
|
凍融次數(shù) |
0次 |
10次 |
30次 |
50次 |
|
Ct均值 |
22.97 |
22.87 |
22.99 |
22.84 |
|
△Ct |
- |
-0.09 |
0.02 |
-0.12 |
|
4℃保存時間 |
0 h |
24 h |
48 h |
72 h |
|
Ct均值 |
22.83 |
22.89 |
23.05 |
23.16 |
|
△Ct |
- |
0.06 |
0.22 |
0.3 |
圖4. Hieff® Unicon Power預(yù)混液及其配制體系穩(wěn)定性俱佳
以1 ng 人gDNA為模板，使用Hieff Unicon® Power預(yù)混液在不同凍融次數(shù)或體系配制后4℃放置不同時間條件下，檢測TFRC基因擴(kuò)增情況。結(jié)果顯示Hieff Unicon® Power預(yù)混液經(jīng)50次反復(fù)凍融或體系配制后4℃保存24h，擴(kuò)增性能無變化（溶解曲線圖數(shù)據(jù)未做展示）。
5. 兼容快速程序與標(biāo)準(zhǔn)程序：
|
30%GC-1號 |
30%GC-2號 |
50%GC-1號 |
50%GC-2號 |
70%GC-1號 |
70%GC-2號 |
|
|
標(biāo)準(zhǔn)程序 |
23.4 |
22.79 |
23.79 |
23.52 |
23.23 |
23.60 |
|
快速程序 |
23.29 |
23.04 |
23.8 |
23.57 |
23.48 |
23.52 |
|
△Ct |
0.11 |
0.25 |
0.01 |
0.05 |
0.15 |
0.08 |
| 標(biāo)準(zhǔn)程序 | 快速程序 | ||||
| 95℃ | 5 min | 95℃ | 30 sec | ||
| 95℃ | 10 sec | 95℃ | 10 sec | ||
| 60℃ | 30 sec | 40 Cycles | 60℃ | 15 sec | 40 Cycles |
圖6. Hieff® Unicon Power預(yù)混液讓擴(kuò)增時間大大縮短
以1 ng人gDNA為模板，擴(kuò)增不同GC基因片段（30-70%），比較Hieff Unicon® Power預(yù)混液在標(biāo)準(zhǔn)程序和快速程序下的擴(kuò)增效果。結(jié)果顯示Hieff Unicon® Power預(yù)混液可兼容快速擴(kuò)增程序和標(biāo)準(zhǔn)擴(kuò)增程序，使用快速程序可縮短擴(kuò)增時間。
常見問題
Q：如何選擇產(chǎn)品？
A：
|
產(chǎn)品名稱 |
貨號 |
特異性 |
擴(kuò)增效率 |
靈敏度 |
性價比 |
|
11195ES |
★★★★★ |
★★★★☆ |
★★★☆☆ |
★★★☆☆ |
|
|
11198ES |
★★★★☆ |
★★★★☆ |
★★★★☆ |
★★★★☆ |
|
|
11201ES |
★★★★☆ |
★★★★★ |
★★★☆☆ |
★★★★★ |
Q：Hieff UNICON® Power qPCR SYBR Green Master Mix產(chǎn)品可應(yīng)用于哪些實驗？
A：可用于對特異性要求比較高或較難實現(xiàn)特異性擴(kuò)增的基因片段。這款產(chǎn)品極大程度上避免了引物二聚體、非特異性擴(kuò)增的出現(xiàn)，特別適合于引物中有單個堿基不同的擴(kuò)增。
Q：建議的模板加入量？
A：20 μL反應(yīng)體系，未經(jīng)稀釋的cDNA加入量建議不超過2 μL。
Q：試劑如何儲存及保質(zhì)期？
A：建議-20℃保存，有效期1年。
訂購信息
|
產(chǎn)品名稱 |
貨號 |
規(guī)格 |
|
11195ES08 |
5 ml |
|
|
Hieff UNICON® Power qPCR SYBR Green Master Mix (抗體法，Low Rox) |
11196ES08 |
5 ml |
|
Hieff UNICON® Power qPCR SYBR Green Master Mix (抗體法，High Rox) |
11197ES08 |
5 ml |
相關(guān)產(chǎn)品
|
產(chǎn)品名稱 |
貨號 |
規(guī)格 |
|
Hifair® II 1st Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR(gDNA digester plus) |
11123ES60 |
100 T |
|
11201ES08 |
5 ml |
|
|
11202ES08 |
5 ml |
|
|
11203ES08 |
5 ml |
HB190306
