產(chǎn)品描述

本試劑盒是利用拓撲異構酶（Topoisomerase）高效快速連接DNA片段的原理進一步研發(fā)而成，與傳統(tǒng)的T4連接酶相比，具有以下優(yōu)勢：

1）快速，僅需1-5分鐘即可完成連接反應。

2）高效，無自連現(xiàn)象，陽性克隆率接近100%，無需設置藍白斑篩選；

3）操作簡單，從連接到涂板僅需15-20 min。操作過程省去冰浴、熱激和1 h復蘇。

4）可連接長達5 kb目的產(chǎn)物；5）Hieff Clone^® Topo-blunt simple vector不含多克隆酶切位點（MCS），使用者在引入后續(xù)酶切位點進行酶切操作時，不會受到MCS位點的影響，從而增加酶切效率以及克隆成功率。

 

產(chǎn)品用途

平端PCR產(chǎn)物的克隆。

克隆后PCR產(chǎn)物的快速測序（使用M13F/M13R引物）。

 

產(chǎn)品組分

組分編號	組分名稱	產(chǎn)品貨號（規(guī)格）
		10910ES20（20 T）
10910-A	pESI-Blunt simple vector (30 ng/μL)	20 μL
10910-B	1 kb control insert (40 ng/μL)	5 μL
10910-C	10×Enhancer	20 μL

 

運輸和保存方法

冰袋運輸。-20℃保存，避免反復凍融。有效期一年。

 

注意事項

1）pESI-Blunt simple vector (30 ng/μL) 插入位點兩端不含多克隆酶切位點，需要在PCR設計引物時引入合適酶切位點。

2）為了您的安全和健康，請穿實驗服并佩戴一次性手套操作。

3) 本產(chǎn)品僅作科研用途！

 

使用方法

一、Control DNA 片段的克隆實驗

1）在無菌微量離心管中配制下列DNA溶液，以10 μL為例。

組分	用量
10 ´ Enhancer	1 μL
1 kb control insert (40 ng/μL)	1 μL
pESI-Blunt simple vector (30 ng/μL)	1 μL
ddH2O	7 μL

2）混勻上述體系。于室溫（20-30℃）反應5 min。

【注】：連接反應不可于冰上進行。室溫下孵育時，不建議您超過5分鐘；但是，如果您的PCR產(chǎn)物濃度較低或者您要克隆一個長片段，則可以適當延長孵育時間。

3）連接產(chǎn)物可直接轉化或于-20℃保存。

4）全量10 μL加入100 μL感受態(tài)細胞，輕輕混勻，室溫放置5 min。

【注】：a）也可取5 μL連接液，加入50 μL感受態(tài)細胞中（加入體積不超過感受態(tài)細胞體積的1/10)。

b）通常使用商品化的感受態(tài)細胞不需要冰浴和熱休克、室溫放置5 min便可獲得足夠多轉化子，如果感受態(tài)細胞效率較低時，可以按照冰浴熱激的標準程序進行。

5）加300-500 μL LB或者SOC培養(yǎng)基(不含抗生素)，37℃ 180 rpm振蕩培養(yǎng)10 min。
6）取200 μL菌液涂板（含氨芐抗性的LB或SOC固體培養(yǎng)基），培養(yǎng)過夜（如果預計轉化子少，為得到較多克隆，4000 rpm 離心1 min，吸棄掉部分上清，保留100 μL，輕彈懸浮菌體，取全部菌液涂板）。

 

二、 一般DNA片段的克隆實驗

所插入片段為平末端產(chǎn)物，利用高保真酶（如Canace高保真酶，Yeasen Cat#10135）擴增得到的產(chǎn)物如無非特異性條帶、引物二聚體可直接進行連接反應。

否則建議膠回收后使用。

【注】：a、PCR產(chǎn)物不能磷酸化。

b、如擴增模板為質(zhì)粒，模板質(zhì)粒會在后續(xù)實驗中引起假陽性，因此推薦PCR產(chǎn)物進行膠回收后連接。

1）按照下表配制連接體系（以10 μL為例）

組分	用量
10 ´ Enhancer	1 μL
pESI-Blunt simple vector (30 ng/μL)	1 μL
插入片段	0.5-8 μL
ddH2O	To 10 μL

【注】：a）可根據(jù)具體實驗情況按照上述比例調(diào)整反應體系。

b）不同的插入片段所用量參考下表：

插入片段大小	推薦用量
0.1-1 kb	20-50 ng
1-2 kb	50-100 ng
2-5 kb	100-200 ng

2）混勻上述體系。于室溫（20-30℃）反應5 min。

【注】：連接反應不可于冰上進行。室溫下孵育時，不建議您超過5分鐘；但是，如果您的PCR產(chǎn)物濃度較低或者您要克隆一個長片段，則可以適當延長孵育時間。

3）全量10 μL加入100 μL感受態(tài)細胞，輕輕混勻，室溫放置5 min。

【注】：a）也可取5 μL連接液，加入50 μL感受態(tài)細胞中（加入體積不超過感受態(tài)細胞體積的1/10)。

b）通常使用商品化的感受態(tài)細胞不需要冰浴和熱休克、室溫放置5 min便可獲得足夠多轉化子，如果感受態(tài)細胞效率較低時，可以按照冰浴熱激的標準程序進行。

4）加300-500 μL LB或者SOC培養(yǎng)基(不含抗生素)，37℃ 180 rpm振蕩培養(yǎng)10 min。
【注】：通常商品化的感受態(tài)細胞不超過2 kb插入片段情況下，10 min復蘇可以得到足夠多轉化子，如果感受態(tài)效率低或者插入片段長轉化子少的情況下可以提高復蘇時間到30-60 min以得到更多的轉化子。
5） 取200 μL菌液涂板（含氨芐抗性的LB或SOC固體培養(yǎng)基），培養(yǎng)過夜（如果預計轉化子少，為得到較多克隆，4000 rpm 離心1 min，吸棄掉部分上清，保留100 μL，輕彈懸浮菌體，取全部菌液涂板）。

6）轉化子的篩選鑒定

a）菌落/菌液PCR鑒定；

b）質(zhì)粒大小鑒定：挑取單克隆，抽提質(zhì)粒后可根據(jù)質(zhì)粒大小進行鑒定。

c）酶切鑒定：根據(jù)克隆實驗設計，選擇合適的限制性內(nèi)切酶進行鑒定。
d) 測序分析：可選測序引物序列如下：

M13F：TGTAAAACGACGGCCAGT
M13R：CAGGAAACAGCTATGACC
【注】：本制品陽性率相當高，一般情況下，陽性克隆率接近100%，只要是長出來的菌落正常（不是污染的雜菌，轉化子數(shù)量也不算太少），基本就是陽性克隆，因此插入片段不超過2-3 kb的情況下可以不用鑒定直接挑1-2個菌去測序。

pESI-Blunt simple vector 圖譜

pESI-Blunt simple vector sequence

ORIGIN

       1 cttgaagtgg tggcctaact acggctacac tagaagaaca gtatttggta tctgcgctct

       61 gctgaagcca gttacctcgg aaaaagagtt ggtagctctt gatccggcaa acaaaccacc

      121 gctggtagcg gtggtttttt tgtttgcaag cagcagatta cgcgcagaaa aaaaggatct

      181 caagaagatc ctttgatttt ctaccgaaga aaggcccacc cgtgaaggtg agccagtgag

      241 ttgattgtgt aaaacgacgg ccagtgtctg aggctcgctt cagtcctgat gcttgttatc

      301 gtattcgcgt gtcgccctta agggcgacac gcgaagtcga tgtcgcgtct gcctgaagtc

      361 aatactgacg atggtcatag ctgtttcctg tccatagcag aaagtcaaaa gcctccgacc

      421 ggaggctttt gacttgatcg gcacgtaaga ggttccaact ttcaccataa tgaaataaga

      481 tcactaccgg gcgtattttt tgagttatcg agattttcag gagctaagga agctaaaatg

      541 agtattcaac atttccgtgt cgcccttatt cccttttttg cggcattttg ccttcctgtt

      601 tttgctcacc cagaaacgct ggtgaaagta aaagatgctg aagatcagtt gggtgcacga

      661 gtgggttaca tcgaactgga tctcaacagc ggtaagatcc ttgagagttt tcgccccgaa

      721 gaacgttttc caatgatgag cacttttaaa gttctgctat gtggcgcggt attatcccgt

      781 attgacgccg ggcaagagca actcggtcgc cgcatacact attctcagaa tgacttggtt

      841 gagtactcac cagtcacaga aaagcatctt acggatggca tgacagtaag agaattatgc

      901 agtgctgcca taaccatgag tgataacact gcggccaact tacttctgac aacgatcgga

      961 ggaccgaagg agctaaccgc ttttttgcac aacatggggg atcatgtaac tcgccttgat

     1021 cgttgggaac cggagctgaa tgaagccata ccaaacgacg agcgtgacac cacgatgcct

     1081 gtagcaatgg caacaacgtt gcgcaaacta ttaactggcg aactacttac tctagcttcc

     1141 cggcaacaat taatagactg gatggaggcg gataaagttg caggaccact tctgcgctcg

     1201 gcccttccgg ctggctggtt tattgctgat aaatctggag ccggtgagcg tgggtctcgc

     1261 ggtatcattg cagcactggg gccagatggt aagccctccc gtatcgtagt tatctacacg

     1321 acggggagtc aggcaactat ggatgaacga aatagacaga tcgctgagat aggtgcctca

     1381 ctgattaagc attggtaatg agggcccaaa tgtaatcacc tggctcacct tcgggtgggc

     1441 ctttctgcgt tgctggcgtt tttccatagg ctccgccccc ctgacgagca tcacaaaaat

     1501 cgatgctcaa gtcagaggtg gcgaaacccg acaggactat aaagatacca ggcgtttccc

     1561 cctggaagct ccctcgtgcg ctctcctgtt ccgaccctgc cgcttaccgg atacctgtcc

     1621 gcctttctcc cttcgggaag cgtggcgctt tctcatagct cacgctgtag gtatctcagt

     1681 tcggtgtagg tcgttcgctc caagctgggc tgtgtgcacg aaccccccgt tcagcccgac

     1741 cgctgcgcct tatccggtaa ctatcgtctt gagtccaacc cggtaagaca cgacttatcg

     1801 ccactggcag cagccactgg taacaggatt agcagagcga ggtatgtagg cggtgctaca

     1861 gagtt

//

【注】：黃底為多克隆酶切位點序列

相關產(chǎn)品

產(chǎn)品名稱	貨號	規(guī)格
Hieff Clone® Zero TOPO-TA Cloning Kit 零背景TOPO-TA克隆試劑盒HOT	10907ES20	20 T
Hieff Clone® Zero TOPO-TA Simple Cloning Kit, MCS-Depleted零背景TOPO-TA克隆試劑盒（不含MCS多克隆酶切位點）	10908ES20	20 T
Hieff Clone® Zero TOPO-Blunt Cloning Kit零背景TOPO-Blunt平末端克隆試劑盒HOT	10909ES20	20 T
2×Hieff® PCR Master Mix (With Dye) HOT	10102ES03/08	1/5×1 mL
2×Hieff® Robust PCR Master Mix（With Dye) HOT	10106ES03/08	1/5×1 mL
Hieff Canace® Gold High-Fidelity DNA Polymerase 高保真DNA聚合酶HOT	10148ES60/76	100/500 U

  HB220909