Hieff Clone? Plus Multi One Step Cloning Kit
批量采購(gòu)， 請(qǐng)點(diǎn)擊詢價(jià)
產(chǎn)品說明書
FAQ
COA
已發(fā)表文獻(xiàn)
新升級(jí)產(chǎn)品10923ES重磅來(lái)襲！
更強(qiáng)的連接效率+更省的試劑量！一起點(diǎn)擊下方圖片查看新產(chǎn)品吧~~~
Hieff Clone® Plus Multi One Step Cloning Kit是一款簡(jiǎn)便、快速、高效的DNA定向克隆產(chǎn)品，該試劑盒可以將PCR產(chǎn)物定向克隆至任何載體的任何位點(diǎn)，可高效克隆50 bp-10 kb片段。將載體線性化，并在插入片段正、反向PCR引物5’端引入15-25 bp的線性化載體末端同源序列，使得插入片段PCR產(chǎn)物5’和3’末端分別帶有與線性化載體兩末端對(duì)應(yīng)的完全一致的序列。PCR產(chǎn)物和線性化載體在重組酶的作用下，僅需50℃反應(yīng)20 min即可進(jìn)行轉(zhuǎn)化，完成定向克隆?？寺￡?yáng)性率可達(dá)95%以上。
試劑盒中2×Hieff Clone® MultiS Enzyme Premix預(yù)混了重組酶和重組反應(yīng)所需緩沖液，并添加了獨(dú)特的重組增強(qiáng)因子，可顯著提高重組克隆效率。使用該試劑盒，可以一次實(shí)現(xiàn)多至5個(gè)片段的順序拼接克隆。
產(chǎn)品組分
|
組分編號(hào) |
組分名稱 |
10912ES08 |
10912ES10 |
|
10912-A |
2× Hieff Clone® MultiS Enzyme Premix |
50 μL |
100 μL |
|
10912-B |
500 bp Control Insert (25 ng/μL) |
5 μL |
5 μL |
|
10912-C |
pUC 19 Control Vector, linearized (50 ng/μL) |
5 μL |
5 μL |
產(chǎn)品應(yīng)用
快速克??；定向克隆；定點(diǎn)突變。
儲(chǔ)存條件
冰袋運(yùn)輸。-25~-15℃保存，有效期1年。
注意事項(xiàng)
1.為了您的安全和健康，請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并佩戴一次性手套操作。
2.本產(chǎn)品僅作科研用途！
使用說明
圖1 Hieff Clone®多片段一步法快速克隆試劑盒實(shí)驗(yàn)流程圖。
①載體線性化：酶切或反向PCR制備線性化載體。
②插入片段的制備：由PCR制備，所用擴(kuò)增引物在設(shè)計(jì)時(shí)需在其5’端添加同源序列（圖中以紅色、黃色、紫色和綠色標(biāo)記)，使得擴(kuò)增產(chǎn)物之間以及擴(kuò)增產(chǎn)物與線性化載體之間各有一段同源序列。
1. 制備線性化載體
選擇合適的克隆位點(diǎn)，并對(duì)載體進(jìn)行線性化。建議盡量選擇無(wú)重復(fù)序列且GC含量均勻的區(qū)域進(jìn)行克隆。載體克隆位點(diǎn)上下游25 bp區(qū)域內(nèi)GC含量均在40%-60%范圍內(nèi)最佳。線性化載體可通過限制性內(nèi)切酶酶切或反向PCR擴(kuò)增獲得。
1）酶切制備線性化載體
a. 雙酶切線性化：線性化完全，轉(zhuǎn)化背景低。建議使用。
b. 單酶切線性化：線性化程度較差?？蛇m當(dāng)延長(zhǎng)酶切時(shí)間以降低轉(zhuǎn)化背景。
【注】：不含插入片段的假陽(yáng)性克隆是由未線性化環(huán)狀載體轉(zhuǎn)化而形成的。若這種假陽(yáng)性克隆比例較高，建議重新制備線性化載體。
2）反向PCR擴(kuò)增制備線性化載體
建議使用高保真聚合酶（如：2×Hieff Canace® Plus PCR Master Mix(With Dye)，Cat#10154ES）進(jìn)行載體擴(kuò)增，以減少擴(kuò)增突變的引入。PCR擴(kuò)增模板應(yīng)盡量使用預(yù)線性化質(zhì)粒，以防止殘留環(huán)狀質(zhì)粒模板對(duì)克隆陽(yáng)性率的影響。
Hieff Clone®重組反應(yīng)體系兼容幾乎所有酶切反應(yīng)體系和常規(guī)PCR反應(yīng)體系，當(dāng)載體酶切產(chǎn)物或反向PCR擴(kuò)增產(chǎn)物純度較高時(shí)，可以無(wú)需純化，直接進(jìn)行重組反應(yīng)。但純度較低且有可能含有未線性化環(huán)狀質(zhì)粒時(shí)，建議使用高質(zhì)量的試劑盒對(duì)線性化載體進(jìn)行膠回收純化，以提高產(chǎn)物純度并去除一部分未線性化的環(huán)狀載體，有利于提高重組效率。
2. PCR擴(kuò)增制備插入片段
1）設(shè)計(jì)擴(kuò)增引物
Hieff Clone®引物設(shè)計(jì)方式：通過在插入片段正、反向PCR引物的5’端引入15-25 bp（不包括酶切位點(diǎn)）的線性化載體末端同源序列，使得插入片段PCR產(chǎn)物5’和3’末端分別帶有與線性化載體兩末端對(duì)應(yīng)的完全一致的序列。
推薦使用翌圣無(wú)縫克隆引物設(shè)計(jì)軟件，自動(dòng)生成插入片段的擴(kuò)增引物。若手動(dòng)設(shè)計(jì)，可參照以下實(shí)例。以在pUC18載體（注：與該試劑盒中提供的C組分不同，C組分為pUC19）的EcoR I 和Hind III 酶切位點(diǎn)間插入三段基因的引物設(shè)計(jì)為例，引物具體設(shè)計(jì)方案如下：
首先設(shè)計(jì)第一片段的正向擴(kuò)增引物和第三片段的反向擴(kuò)增引物（與載體相鄰的兩個(gè)插入片段）。
第一片段正向擴(kuò)增引物設(shè)計(jì)方式：
5’—上游載體末端同源序列+酶切位點(diǎn)（可保留或刪除）+第一片段基因特異性正向擴(kuò)增序列—3’
第三片段反向擴(kuò)增引物設(shè)計(jì)方式：
3’—第三片段基因特異性反向擴(kuò)增序列+酶切位點(diǎn)（可保留或刪除）+下游載體末端同源序列—5’
【注】：
①基因特異性正/反向擴(kuò)增序列即常規(guī)插入片段正/反向擴(kuò)增引物序列；
②上游/下游載體末端同源序列為線性化載體最末端序列（用于同源重組），GC含量40%-60%為佳。
圖2 與載體相鄰的兩個(gè)插入片段引物設(shè)計(jì)方案
其次設(shè)計(jì)第一片段的反向擴(kuò)增引物和第二片段的正向擴(kuò)增引物。用于片段之間進(jìn)行重組的同源序列可以添加至前方片段的反向擴(kuò)增引物中，也可以添加至后方片段的正向擴(kuò)增引物中，還可以兩片段各添加一部分。以將同源序列添加至前方片段（第一片段）的反向擴(kuò)增引物中為例，引物具體設(shè)計(jì)方案如圖3所示：
第一片段反向擴(kuò)增引物設(shè)計(jì)方式：
3’—第一片段基因特異性反向擴(kuò)增序列+第二片段5’端同源序列—5’
第二片段正向擴(kuò)增引物設(shè)計(jì)方式：
5’—第二片段基因特異性正向擴(kuò)增序列—3’
【注】：
①基因特異性正/反向擴(kuò)增序列即常規(guī)插入片段正/反向擴(kuò)增引物序列；
②第二片段5’端同源序列即用于第一片段與第二片段進(jìn)行重組的添加序列。
最后設(shè)計(jì)第二片段的反向擴(kuò)增引物和第三片段的正向擴(kuò)增引物。設(shè)計(jì)方式與第一片段的反向擴(kuò)增引物和第二片段的正向擴(kuò)增引物設(shè)計(jì)方式一致。具體方案參見圖3。
圖3 第一片段的反向擴(kuò)增引物和第二片段的正向擴(kuò)增引物設(shè)計(jì)方案
【注】：最終引物長(zhǎng)度超過40 bp，建議選用PAGE純化方式進(jìn)行引物合成。計(jì)算擴(kuò)增引物退火溫度時(shí)，只需計(jì)算基因特異性擴(kuò)增序列的Tm值，載體末端同源序列不應(yīng)參與計(jì)算，為了得到高效率克隆，建議Tm≥48℃。
2）插入片段PCR擴(kuò)增
插入片段擴(kuò)增可用任意PCR酶擴(kuò)增，無(wú)需考慮產(chǎn)物末端有無(wú)A尾（重組過程中將被去除，在最終載體中不會(huì)出現(xiàn)）。但為了減少擴(kuò)增突變的引入，建議使用高保真聚合酶進(jìn)行擴(kuò)增（如：2×Hieff Canace® Plus PCR Master Mix(With Dye)，Cat#10154ES）。
PCR擴(kuò)增結(jié)束后，取少量產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳以檢驗(yàn)擴(kuò)增產(chǎn)量和特異性。Hieff Clone®重組反應(yīng)體系兼容常規(guī)PCR反應(yīng)體系。因此，如果擴(kuò)增模板不是與載體抗性相同的環(huán)狀質(zhì)粒，且PCR產(chǎn)物電泳條帶單一，則擴(kuò)增產(chǎn)物可以無(wú)需純化，直接用于重組反應(yīng)。但PCR擴(kuò)增產(chǎn)物純度較低時(shí)，建議使用高質(zhì)量的試劑盒對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行膠回收純化，以提高產(chǎn)物純度，有利于提高重組效率。
3. 線性化載體與插入片段濃度測(cè)定
推薦使用瓊脂糖凝膠電泳比較條帶亮度的方法對(duì)DNA進(jìn)行定量。將線性化載體和插入片段擴(kuò)增產(chǎn)物做數(shù)個(gè)等體積稀釋梯度，原始產(chǎn)物和稀釋后產(chǎn)物各取1 μL進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，與DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)(DNA Marker)比較條帶亮度以確定其近似濃度。
4.重組反應(yīng)
1）線性化載體與插入片段使用量計(jì)算
Hieff Clone® Plus Multi重組反應(yīng)體系最適DNA使用量為每片段（包括線性化載體）0.03 pmoL。該摩爾數(shù)對(duì)應(yīng)的DNA質(zhì)量可由以下公式粗略計(jì)算獲得：
每片段最適使用量= [0.02×載體堿基對(duì)數(shù)]ng (0.03 pmoL)
例如，將長(zhǎng)度為0.5 kb、1 kb、2 kb三插入片段克隆至長(zhǎng)度為5 kb的載體時(shí)，各片段最適使用量應(yīng)為：
線性化載體最適使用量：0.02 × 5000 = 100 ng；
0.5kb插入片段最適使用量應(yīng)為：0.02 × 500 = 10 ng；
1 kb插入片段最適使用量應(yīng)為：0.02 × 1,000 = 20 ng；
2 kb插入片段最適使用量應(yīng)為：0.02 × 2,000 = 40 ng。
【注】：
1）插入片段DNA使用量應(yīng)大于10 ng。當(dāng)使用上述公式計(jì)算DNA最適使用量低于這個(gè)值時(shí)，直接使用10 ng即可。
2）線性化載體的使用量應(yīng)在50-200 ng之間。當(dāng)使用上述公式計(jì)算最適使用量超出這個(gè)范圍時(shí)，則選擇最低或最高使用量即可。
3）線性化載體和插入片段擴(kuò)增產(chǎn)物未純化，直接使用時(shí)，使用總體積應(yīng)不超過反應(yīng)體系體積的1/5，如20 μL體系不超過4 μL。
2）反應(yīng)體系（推薦冰上配制，各組分使用前需混勻）
|
組分 |
重組反應(yīng) |
陰性對(duì)照-1 |
陰性對(duì)照-2 |
陽(yáng)性對(duì)照 |
|
ddH2O |
Up to 20 μL |
Up to 20 μL |
Up to 20 μL |
Up to 20 μL |
|
2× Hieff Clone® MultiS Enzyme Premix |
10 μL |
0 μL |
0 μL |
10 μL |
|
線性化載體 |
X μL |
X μL |
0 μL |
1 μL |
|
N個(gè)插入片段 |
Y μL |
0 μL |
Y μL |
1 μL |
表1 反應(yīng)體系
【注】：
1）X和Y分別是根據(jù)公式計(jì)算得到線性化載體和插入片段用量。
2）陰性對(duì)照-1可用來(lái)確認(rèn)線性化載體有無(wú)環(huán)狀質(zhì)粒殘留，可選擇性進(jìn)行。
3）當(dāng)插入片段擴(kuò)增模板是與載體抗性相同的環(huán)狀質(zhì)粒時(shí)，可用陰性對(duì)照-2來(lái)確認(rèn)有無(wú)環(huán)狀質(zhì)粒模板殘留，可選擇性進(jìn)行。
4）試劑盒中提供陽(yáng)性對(duì)照反應(yīng)所需組分（B組分和C組分），可用來(lái)排除其他實(shí)驗(yàn)材料及操作因素的影響，可選擇性進(jìn)行。
3）重組反應(yīng)
a. 體系配制完成后，用移液器輕輕吸打混勻各組分，短暫離心將反應(yīng)液收集至管底。
b. 置于50℃反應(yīng)20 -50 min。當(dāng)插入片段總和＞5 kb時(shí)，建議提高孵育時(shí)間到30-50 min可以增大重組效率。
【注】：建議在PCR儀或水浴鍋等溫控精確的儀器上進(jìn)行反應(yīng)。
c. 待反應(yīng)完成后，建議將反應(yīng)管置于冰上冷卻5 min，以防溫度過高降低感受態(tài)轉(zhuǎn)化效率。
d. 反應(yīng)產(chǎn)物可直接進(jìn)行轉(zhuǎn)化，也可儲(chǔ)存于-20℃，待需要時(shí)解凍轉(zhuǎn)化。
5.重組產(chǎn)物轉(zhuǎn)化、涂板
1）在冰上解凍克隆感受態(tài)細(xì)胞（如：DH5α Chemically Competent Cell，Cat#11802ES）。
2）取10 μL冷卻重組產(chǎn)物，加入到100 μL感受態(tài)細(xì)胞中，輕彈管壁數(shù)下混勻，在冰上放置30 min。
3）42℃熱激90 sec，冰浴孵育2 min。
4）加入900 μL SOC或LB培養(yǎng)基，37℃孵育10 min充分復(fù)蘇。37℃，200 rpm，搖菌45 min。
5）5,000 rpm離心3 min，棄掉900 μL上清。用剩余培養(yǎng)基將菌體重懸，用無(wú)菌涂布棒在含有正確抗性的平板上輕輕涂勻。待菌液被吸收，將平板倒置，于37℃過夜培養(yǎng)。
6.克隆鑒定
最方便快捷的方法是菌落PCR。用無(wú)菌的槍頭或牙簽將單個(gè)菌落挑至20-50 μL LB培養(yǎng)基中混勻，直接取1 μL作為PCR模板。推薦至少用一條通用測(cè)序引物進(jìn)行菌落PCR，這樣可以避免PCR假陽(yáng)性的產(chǎn)生。后續(xù)也可做酶切或測(cè)序鑒定。
應(yīng)用實(shí)例
圖4 Hieff Clone® Plus Multi One Step Cloning Kit進(jìn)行三片段克隆。
A：重組轉(zhuǎn)化平板。B：插入片段和載體濃度檢測(cè)電泳圖。C：PCR方法鑒定每個(gè)單片段和最終連接基因。箭頭指示目的條帶。載體：pCAMIBA1302，10 kb，三個(gè)插入片段長(zhǎng)度：1 kb，1.5 kb和2.5 kb，重組反應(yīng)條件：50℃，20 min。
推薦商品
推薦產(chǎn)品應(yīng)用
