產(chǎn)品簡介

 

Hieff Clone® Universal II One Step Cloning Kit是新一代的同源重組克隆試劑盒，精心優(yōu)化的第二代2× Hieff Clone® Universal II Enzyme Premix預(yù)混了重組酶和重組反應(yīng)所需緩沖液，并添加了獨(dú)特的重組增強(qiáng)因子，可顯著提高重組克隆效率。

該試劑盒可以將PCR產(chǎn)物定向克隆至任何載體的任何位點(diǎn)，兼容未純化PCR產(chǎn)物、直接回收的PCR產(chǎn)物、低濃度的膠回收產(chǎn)物，本產(chǎn)品可重組同源臂GC含量30%-70%的接頭片段。將載體完全線性化，并在插入片段正、反向PCR引物5’端引入15-25 bp的線性化載體末端同源序列，使得插入片段PCR產(chǎn)物5’和3’末端分別帶有與線性化載體兩末端對(duì)應(yīng)的完全一致的序列。PCR產(chǎn)物和線性化載體在重組酶的作用下，在50℃條件下最快僅需5 min即可完成重組反應(yīng)?？寺￡栃月士蛇_(dá)95%以上。

 

組分信息

 

組分編號(hào)	組分名稱	10923ES05	10923ES20	10923ES50	10923ES53
10923-A	2 × Hieff Clone® Universal II Enzyme Premix	50 μL	200 μL	500 μL	500 μL
10923-B	500 bp control insert (25 ng/μL)	5 μL	5 μL	5 μL	5 μL
10923-C	pUC 19 control vector, linearized (50 ng/μL)	5 μL	5 μL	5 μL	5 μL
10923-D	LB Powder預(yù)混培養(yǎng)基	-	-	-	3×0.5 L

 

儲(chǔ)存條件

 

組分A、B、C：-25~-15℃保存，有效期1年。

組分D：室溫保存，有效期2年。

 

性能展示

 

單片段6 μL小體系高效重組

圖1. 在6 μL小體系非復(fù)蘇感受態(tài)下，連接10 ng低投入量單片段。結(jié)果顯示，10923ES性能好于競品，連接效率高，菌落數(shù)多，陽性率達(dá)100%。A-B：重組轉(zhuǎn)化平板。載體（10 kb）和插入片段（1 kb）摩爾比為1:2。C：插入片段PCR鑒定電泳圖，M：Yeasen 10505ES。

低濃度多片段高效重組

圖2. 分別連接低濃度的五片段和六片段。結(jié)果顯示，10923ES在低濃度下連接性能穩(wěn)定，菌落數(shù)多，陽性率100%。A-B：重組轉(zhuǎn)化平板。載體（11.6 kb）和插入片段（5片段共5.6 kb、六片段共7.6 kb）摩爾比為1:2。C-D：插入片段PCR鑒定電泳圖，M：Yeasen 10505ES，菌P長度2.6 kb。

 

簡版使用說明

 

1. 重組反應(yīng)

1）線性化載體和插入片段使用量

Hieff Clone^®重組反應(yīng)體系各個(gè)片段及載體插入總濃度為0.02 - 1 pmol。載體與各個(gè)插入片段摩爾比為1:2*。對(duì)應(yīng)的DNA質(zhì)量可由以下公式計(jì)算獲得：

50 ng 5,000 bp的DNA片段約為0.015 pmol
50 ng 500 bp的DNA片段約為0.15 pmol

*當(dāng)插入片段長度＞載體時(shí)，最適載體與插入片段使用量的計(jì)算方式應(yīng)互換，即插入片段當(dāng)做載體，載體當(dāng)做插入片段進(jìn)行計(jì)算。

**線性化載體及插入片段的反應(yīng)終濃度最低可達(dá)到1 ng/μL。當(dāng)上述公式計(jì)算的值低于或超過體系范圍時(shí)，直接使用最低/最高投入量即可。

***線性化載體和插入片段擴(kuò)增產(chǎn)物未純化直接使用時(shí)，使用總體積應(yīng)不超過反應(yīng)體系體積的1/5，如20 μL體系不超過4 μL。

• 簡便計(jì)算公式：
• 推薦翌圣官網(wǎng)—支持中心—生物計(jì)算器—克隆連接投入量計(jì)算板塊，輸入片段數(shù)、濃度、大小，即可獲得投入量：

http://www.jingtongjz.com/calculator.html#/cloning-link/

2） 重組反應(yīng)體系（可等比擴(kuò)大或縮減反應(yīng)體系，冰上配制，各組分使用前需混勻）

組分	重組反應(yīng)體系	陽性對(duì)照	陰性對(duì)照-A	陰性對(duì)照-B
2× Hieff Clone® Universal II Enzyme Premix	10 μL	10 μL	0 μL	0 μL
每個(gè)插入片段投入量	X μL	1 μL（10923-B）	0 μL	X μL
目的載體投入量	Y μL	1 μL（10923-C）	Y μL	0 μL
ddH2O	To 20 μL	To 20 μL	To 20 μL	To 20 μL

表1 反應(yīng)體系

陽性對(duì)照：排除實(shí)驗(yàn)材料及操作因素的影響。

陰性對(duì)照-A：確認(rèn)線性化載體有無環(huán)狀質(zhì)粒殘留；陰性對(duì)照-B：當(dāng)插入片段原始質(zhì)粒與載體有相同抗性時(shí)，確認(rèn)插入片段有無環(huán)狀質(zhì)粒殘留。

3）重組反應(yīng)條件

1. 體系配制完成后，用移液器輕輕吸打混勻各組分，短暫離心將反應(yīng)液收集至管底。
2. 當(dāng)插入1個(gè)片段時(shí)，反應(yīng)條件為50℃，5 min；當(dāng)插入片段數(shù)為2-6個(gè)時(shí)，建議反應(yīng)條件為50℃，10 -50 min（反應(yīng)時(shí)間隨片段數(shù)增多而延長，如表2所示）。超長載體片段連接，建議反應(yīng)時(shí)間為40-60 min。

連接片段數(shù)	重組反應(yīng)時(shí)間
2	10 min
3	20 min
4	30 min
5	40 min
6	50 min

表2 反應(yīng)時(shí)間

3. 反應(yīng)產(chǎn)物可直接進(jìn)行轉(zhuǎn)化，也可儲(chǔ)存于-20℃，待需要時(shí)解凍轉(zhuǎn)化。

2. 10 min快速轉(zhuǎn)化

1）提前15分鐘將用到的篩選培養(yǎng)基平板拿到37℃預(yù)熱。

2）在冰上解凍快速克隆感受態(tài)細(xì)胞（如：DH5α Fast Chemically Competent Cell，Cat#11803ES）。

3）取10 μL冷卻重組產(chǎn)物，加入到100 μL感受態(tài)細(xì)胞中，輕彈管壁數(shù)下混勻，在冰上放置5 min。

4）用200 μL移液槍將上一步的混合物轉(zhuǎn)移到已經(jīng)37℃預(yù)熱的LB培養(yǎng)基上，均勻涂布。

5）將平板置于37℃培養(yǎng)箱倒置過夜培養(yǎng)。若進(jìn)行藍(lán)白斑篩選操作，平板在37℃至少倒置培養(yǎng)15 h。

3. 克隆鑒定

最方便快捷的方法是菌落PCR。用無菌的槍頭或牙簽將單個(gè)菌落挑至菌落PCR Mix中混勻（如：2×Hieff® Ultra-Rapid II HotStart PCR Master Mix，Cat#10167ES），加入引物直接進(jìn)行PCR反應(yīng)。推薦至少使用一條通用測序引物進(jìn)行菌落PCR，可以避免PCR假陽性的產(chǎn)生。后續(xù)也可用于酶切或測序鑒定。

 

注意事項(xiàng)

 

1. 需自備的材料：

1）自備樣品：自備好線性化載體和插入片段。

2）自備試劑（僅羅列部分）：

a. 超級(jí)感受態(tài)：轉(zhuǎn)化效率＞10⁸ cfu/μg，如翌圣F DH5α快速超級(jí)感受態(tài)細(xì)胞（Cat#11803ES）。

b. 高保真酶：2× Hieff Canace^® AdvanceFast PCR Master Mix (With Dye)（Cat#10164ES）或其他等效產(chǎn)品。

c. 快速菌落PCR mix：2×Hieff® Ultra-Rapid II HotStart PCR Master Mix（Cat#10167ES）或其他等效產(chǎn)品。

d. 核酸染料：YeaRed Nucleic Acid Gel Stain (10,000× in Water)（Cat#10202ES），適用于紫外凝膠成像儀；YeaGreen Nucleic Acid Gel Stain (10,000×in Water)（Cat#10204ES），適用于紫外凝膠成像儀和藍(lán)光切膠儀；或其他等效產(chǎn)品。

3）自備儀器耗材（僅羅列部分）：PCR儀，水平電泳槽，切膠儀，EP管等。

4）制備LB液體培養(yǎng)基、固體平板，操作步驟參考說明書“5. LB培養(yǎng)基配制”。

2. 為了您的安全和健康，請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并佩戴一次性手套操作。

3. 本產(chǎn)品僅作科研用途！

 

常見問答

 

1、最佳克隆位點(diǎn)選擇？

答：在選擇克隆位點(diǎn)時(shí)，應(yīng)避免選擇克隆位點(diǎn)上下游50 bp內(nèi)有重復(fù)序列的區(qū)域。當(dāng)克隆位點(diǎn)上下游25 bp區(qū)域內(nèi)GC含量均在40%-60%范圍內(nèi)時(shí)，重組效率將達(dá)到最大。若高于70%或者低于30%，重組效率會(huì)受到較大影響。

2、無克隆長出或克隆數(shù)較少？

答：出現(xiàn)該情況，建議使用陽性對(duì)照，可排除試劑盒本身的影響，并進(jìn)行進(jìn)一步判定，主要有以下可能情況：

1）引物設(shè)計(jì)不合適：推薦【同源序列（15-25 bp）+完整的酶切位點(diǎn)+基因特異性擴(kuò)增引物】，GC含量40% - 60%。

2）感受態(tài)細(xì)胞效率低：使用新鮮制備或妥善凍存的感受態(tài)細(xì)胞，確保其轉(zhuǎn)化效率>10⁷ cfu/μg。每次操作時(shí)可設(shè)置一組轉(zhuǎn)化質(zhì)粒的對(duì)照實(shí)驗(yàn)，以檢測感受態(tài)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化效率。連接產(chǎn)物體積不應(yīng)超過感受態(tài)細(xì)胞體積的1/10，否則會(huì)降低轉(zhuǎn)化效率。

3）線性化載體和插入片段擴(kuò)增產(chǎn)物的使用量不足/過量，或者比例不佳：盡量按照推薦的量和比例配制重組反應(yīng)體系。

4）線性化載體和插入片段擴(kuò)增產(chǎn)物不純，抑制反應(yīng)：線性化載體和插入片段擴(kuò)增產(chǎn)物未純化，直接使用時(shí)，使用總體積應(yīng)不超過反應(yīng)體系體積的1/5，如20 μL體系不超過4 μL。建議線性化載體、插入片段擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行凝膠回收純化，純化產(chǎn)物溶解在ddH₂O中。

3、出現(xiàn)較多假陽性

答：主要有以下可能情況：

1）載體線性化不完全：即使是痕量未完全酶切的載體也會(huì)產(chǎn)生很高的轉(zhuǎn)化背景?？赏ㄟ^陰性對(duì)照檢測載體是否線性化完全，優(yōu)化酶切體系，提高限制性內(nèi)切酶使用量、延長酶切反應(yīng)時(shí)間、膠回收純化酶切產(chǎn)物等都可以有效減少環(huán)狀質(zhì)粒殘留。

2）插入片段擴(kuò)增產(chǎn)物混有非特異擴(kuò)增產(chǎn)物：建議：①優(yōu)化PCR體系，提高特異性；②膠回收PCR產(chǎn)物；③鑒定更多克隆。

3）反應(yīng)體系中混入了相同抗性的質(zhì)粒：PCR擴(kuò)增模板(載體或插入片段)為環(huán)狀質(zhì)粒時(shí)，若擴(kuò)增產(chǎn)物直接用于重組反應(yīng)，殘留環(huán)狀質(zhì)粒模板會(huì)產(chǎn)生較高的轉(zhuǎn)化背景。建議使用預(yù)線性化質(zhì)粒作為擴(kuò)增模板、擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行DpnI消化或擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行膠回收純化。

4、菌落PCR無條帶

答：主要有以下可能情況：

1）引物不正確：推薦使用載體的通用引物或至少使用一條通用引物進(jìn)行菌落PCR檢測。

2）PCR體系或程序不合適：沒有目的條帶也沒有空質(zhì)粒條帶，建議優(yōu)化PCR體系、程序；或者提取質(zhì)粒，以質(zhì)粒做模板PCR驗(yàn)證；或者進(jìn)行酶切驗(yàn)證。

3）重組失?。?/font>沒有目的條帶，只有空質(zhì)粒的條帶，說明重組不成功，載體線性化不完全，建議優(yōu)化酶切體系。

5、測序無信號(hào)或測序插入片段序列突變

1）菌P條帶亮，但測序無信號(hào)：建議進(jìn)行雙酶切驗(yàn)證，或者搖菌培養(yǎng)單菌落，提取質(zhì)粒DNA重新驗(yàn)證。

2）插入片段序列突變/缺失幾個(gè)堿基：查看測序圖譜，比對(duì)堿基序列峰圖，如為連續(xù)堿基，會(huì)有漏讀或讀錯(cuò)風(fēng)險(xiǎn)。

3）插入片段序列缺失/增加大片段序列：①插入片段與載體的部分位點(diǎn)存在同源互補(bǔ)序列。②實(shí)驗(yàn)中存在插入片段上下游引物（含同源臂）擴(kuò)出的非特異條帶。建議：目的片段切膠回收純化。

Ver. CN20241126