Hieff NGS^® OnePot cDNA & gDNA Library Prep Kit是針對(duì)Illumina^®或者MGI^®測(cè)序平臺(tái)專業(yè)開發(fā)設(shè)計(jì)的新一代酶切法建庫(kù)試劑盒。與傳統(tǒng)的建庫(kù)法比較，本品采用高質(zhì)量的片段化酶，擺脫了繁瑣的超聲過(guò)程，同時(shí)簡(jiǎn)化了操作流程，將片段化模塊與末端修復(fù)模塊合二為一，極大的降低了建庫(kù)的時(shí)間和成本。本試劑盒具有優(yōu)秀的文庫(kù)轉(zhuǎn)化率，可應(yīng)用于常規(guī)動(dòng)植物基因組、微生物基因組等樣本，同時(shí)能兼容cfDNA樣本的建庫(kù)。該試劑盒使用了最新優(yōu)化的連接酶，改善了接頭連接時(shí)的片段自連現(xiàn)象，同時(shí)替換了新型高保真酶，進(jìn)一步提升了擴(kuò)增的均一性和保真性。

Ø 適用500 pg-1 μg的基因組DNA、全長(zhǎng)cDNA（銜接Hieff NGS^® ds-cDNA Synthesis Kit全長(zhǎng)cDNA合成試劑盒（Yeasen Cat#13488））等樣本；
Ø 高質(zhì)量片段化酶，可隨機(jī)切割雙鏈DNA，酶切片段無(wú)偏好性；
Ø 片段化、末端修復(fù)/加A一步完成；
Ø 強(qiáng)擴(kuò)增效率的高保真酶，顯著提高文庫(kù)質(zhì)量及產(chǎn)量；
Ø 適用于cfDNA樣本；
Ø 嚴(yán)格的批次性能與穩(wěn)定性質(zhì)控；

 

產(chǎn)品組分

組分編號(hào)             組分名稱			13502ES24	13502ES96
13502-A		Smearase Buffer	240 μL	960 μL
13502-B		DNA Extra-working Buffer	240 μL	960 μL
13502-C		Smearase Enzyme Mix	120 μL	480 μL
13502-D		Ligation Enhancer	720 μL	2×1440 μL
13502-E		Novel T4 DNA Ligase	120 μL	480 μL
13502-F		2× Ultima HF Amplification Mix	600 μL	2×1200 μL

 

運(yùn)輸與保存方法

干冰運(yùn)輸。-20℃保存。有效期1年。

 

注意事項(xiàng)
一、關(guān)于操作

1. 為了您的安全和健康，請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。

2. 請(qǐng)于使用前將試劑盒各組分置于室溫解凍。解凍后上下顛倒數(shù)次充分混勻，短暫離心后置于冰上待用。

3. 配制各步驟反應(yīng)液時(shí)推薦使用移液器吹打混勻或輕輕振蕩，劇烈振蕩可能會(huì)造成文庫(kù)產(chǎn)出下降。

4. 為避免樣品交叉污染，推薦使用帶濾芯的槍頭，吸取不同樣品時(shí)請(qǐng)更換槍頭。

5. 推薦在帶熱蓋的PCR儀中進(jìn)行各步驟反應(yīng)，使用前應(yīng)預(yù)熱PCR儀至反應(yīng)溫度附近。
6. PCR產(chǎn)物因操作不當(dāng)極容易產(chǎn)生氣溶膠污染，進(jìn)而影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確性。推薦將PCR反應(yīng)體系配制區(qū)和PCR產(chǎn)物純化檢測(cè)區(qū)進(jìn)行強(qiáng)制性的物理隔離；使用專用的移液器等設(shè)備；并定時(shí)對(duì)各實(shí)驗(yàn)區(qū)域進(jìn)行清潔（使用0.5%次氯酸鈉或10%漂白劑進(jìn)行擦拭清理），以保證實(shí)驗(yàn)環(huán)境的潔凈度。
7. 本產(chǎn)品僅作科研用途！

 

二、關(guān)于接頭連接（Adapter Ligation）

Illumina接頭：

1. 本公司可提供短接頭（也稱為小Y接頭、不完整接頭）試劑盒，客戶可根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求進(jìn)行選擇。

目前有雙端 384 種 Index Primers: Hieff NGS® 384 CDI Primer for Illumina® , Set 1~Set 2 （Cat#12412~Cat#12413）。

2. 我們建議選用高質(zhì)量的商業(yè)化接頭。如客戶使用自制接頭，請(qǐng)委托具有NGS引物合成經(jīng)驗(yàn)的公司，并備注需進(jìn)行嚴(yán)格的防污染控制。此外，進(jìn)行接頭退火操作時(shí)，請(qǐng)?jiān)诔瑑襞_(tái)完成。每次只操作一種接頭，防止交叉污染。

3. 使用接頭時(shí)，請(qǐng)?zhí)崆皩⒔宇^取出放在4°C或冰盒上解凍；在室溫操作時(shí)，實(shí)驗(yàn)室溫度最好不要超過(guò)25°C，防止接頭解鏈。

4. 建庫(kù)過(guò)程中，接頭濃度過(guò)高或過(guò)低都會(huì)導(dǎo)致建庫(kù)成功率變低。本試劑盒操作方案中，所加入的接頭體積固定為5 μL，請(qǐng)根據(jù)初始的DNA或者RNA投入量，參考表1對(duì)接頭進(jìn)行稀釋。本公司接頭原始濃度均為15 μM，接頭稀釋液請(qǐng)選擇0.1×TE buffer，稀釋過(guò)的接頭可在4°C保存48小時(shí)。

表1 Input Total RNA/DNA量與接頭使用濃度推薦表

Input Total RNA（參照Cat#13488 RNA投入量）	Adapter stock concentration	Input Total DNA	Adapter stock concentration
≥10 ng	15 μM	1μg~200 ng	15 μM
<10 ng	3 μM	100 ng	10 μM
		50 ng	5 μM
		10 ng	3 μM
		5 ng	1μM
		≤1ng	0.5μM

 

三、關(guān)于文庫(kù)擴(kuò)增（Library Amplification）

文庫(kù)擴(kuò)增步驟需要嚴(yán)格控制擴(kuò)增循環(huán)數(shù)。循環(huán)數(shù)不足，將導(dǎo)致文庫(kù)產(chǎn)量低；循環(huán)數(shù)過(guò)多，又將導(dǎo)致文庫(kù)偏好性增加、重復(fù)度增加、嵌合產(chǎn)物增加、擴(kuò)增突變積累等多種不良后果。表2列舉了使用本試劑盒，獲得1mg文庫(kù)的推薦循環(huán)數(shù)。

表 2 Input Total RNA或者DNA量與擴(kuò)增循環(huán)數(shù)推薦表*

Input Total RNA	Number of cycles	Input Total DNA	Number of cycles
<1 ng	10~12	<1 ng	14~16
1ng	9~10	1 ng	13~14
10 ng	6~7	5 ng	10~11
50ng	4~5	10 ng	9~10
100~1000 ng	4	50 ng	7~8
		100 ng	6~7
		200 ng	5~6

【注】：*由于文庫(kù)產(chǎn)量不僅與投入量和擴(kuò)增循環(huán)數(shù)相關(guān)，樣本質(zhì)量等都會(huì)影響產(chǎn)量。建庫(kù)過(guò)程中請(qǐng)根據(jù)實(shí)際情況綜合考慮，選擇最合適的建庫(kù)條件。

 

四、DNA磁珠純化與分選（Bead-based Clean Up and Size Selection）

1. 建庫(kù)過(guò)程中有多個(gè)步驟需要使用DNA純化磁珠，我們推薦使用Hieff NGS^® DNA Selection Beads (Yeasen Cat#12601)或AMPure^® XP磁珠(Beckman Cat#A63880)進(jìn)行DNA純化和分選。

2. 磁珠使用前應(yīng)先平衡至室溫，否則會(huì)導(dǎo)致得率下降、分選效果不佳。

3. 磁珠每次使用前都應(yīng)充分振蕩混勻或使用移液器上下吹打充分混勻。

4. 轉(zhuǎn)移上清時(shí)，請(qǐng)勿吸取磁珠，即使微量殘留都將影響后續(xù)文庫(kù)質(zhì)量。

5. 磁珠洗滌使用的80%乙醇應(yīng)現(xiàn)用現(xiàn)配，否則將影響回收效率。

6. 產(chǎn)物洗脫前應(yīng)將磁珠置于室溫干燥。干燥不充分容易造成無(wú)水乙醇?xì)埩粲绊懞罄m(xù)反應(yīng)；過(guò)分干燥又會(huì)導(dǎo)致磁珠開裂進(jìn)而降低純化得率。通常情況下，室溫干燥3-5 min足以讓磁珠充分干燥。

7. DNA純化或長(zhǎng)度分選產(chǎn)物如需保存，可使用0.1×TE Buffer洗脫，產(chǎn)物于4°C可保存2天，-20°C可保存1個(gè)月。

 

五、關(guān)于文庫(kù)質(zhì)檢（Library Quality Analysis）

1. 通常情況下，構(gòu)建好的文庫(kù)可通過(guò)長(zhǎng)度分布檢測(cè)和濃度檢測(cè)來(lái)進(jìn)行質(zhì)量評(píng)價(jià)。

2. 文庫(kù)濃度檢測(cè)可使用：基于雙鏈DNA熒光染料的方法，如Qubit^®、PicoGreen^®等；基于qPCR絕對(duì)定量的方法。

3. 推薦使用qPCR方法進(jìn)行文庫(kù)濃度檢測(cè)：Qubit^®等基于雙鏈DNA熒光染料的濃度測(cè)定方法時(shí)，無(wú)法有效區(qū)分單端連接Adapter的產(chǎn)物、兩端均未連接Adapter的產(chǎn)物及其他不完整雙鏈結(jié)構(gòu)產(chǎn)物；qPCR絕對(duì)定量基于PCR擴(kuò)增原理，僅定量樣品中兩端Adapter完整的文庫(kù)（即可測(cè)序的文庫(kù)），可排除單端或雙端都不連接Adapter的不可測(cè)序文庫(kù)的干擾。

4. 文庫(kù)濃度檢測(cè)不可使用：基于光譜檢測(cè)的方法，如NanoDrop^®等。

5. 文庫(kù)長(zhǎng)度分布檢測(cè)，可通過(guò)Agilent Bioanalyzer 2100等基于毛細(xì)管電泳或微控流原理的設(shè)備進(jìn)行檢測(cè)。

 

六、自備材料（Other Material）

1. DNA純化磁珠：Hieff NGS^® DNA Selection Beads（Yeasen Cat#12601）或AMPure^® XP Beads（A63880）或其他等效產(chǎn)品。

2. Adapters：含Index的長(zhǎng)接頭（Yeasen Cat#12615~12618）或者無(wú)Index的短接頭試劑盒（Yeasen Cat#12611~12614）。

3. 文庫(kù)質(zhì)檢：Agilent 2100 Bioanalyzer DNA 1000 Chip/ High Sensitivity Chip或其他等效產(chǎn)品；文庫(kù)定量試劑。

4. 其他材料：無(wú)水乙醇、無(wú)菌超純水、低吸附槍頭、PCR管、磁力架、PCR儀等。

 

建庫(kù)流程圖

   

 圖1 DNA建庫(kù)操作流程

 

使用方法

Step 1 cDNA & gDNA片段化/末端修復(fù)/dA尾添加（DNA Fragment/End Preparation/dA-Tailing）

該步驟將cDNA & gDNA片段化，同時(shí)進(jìn)行末端修復(fù)及dA尾添加。

1. 將表3中各試劑解凍后，顛倒混勻，置于冰上備用。

2. 于冰上配制表3反應(yīng)體系。

表3  DNA片段化/末端修復(fù)/dA尾添加 PCR反應(yīng)體系

名稱	體積（μL）	名稱	體積（μL）
2nd Strand cDNA	35	gDNA	35
Smearase Buffer	10	Smearase Buffer	10
Smearase Enzyme Mix	5	Smearase Enzyme Mix	5
RNase-free H2O	10	DNA Extra-working Buffer	10
Total	60	Total	60

3. 使用移液器輕輕吹打或低速振蕩混勻，并短暫離心將反應(yīng)液離心至管底。

4. 將上述PCR管置于PCR儀，設(shè)置表4所示反應(yīng)程序，進(jìn)行DNA片段化，末端修復(fù)及dA尾添加反應(yīng)。

表4  DNA片段化/末端修復(fù)/dA尾添加 PCR反應(yīng)程序

溫度	時(shí)間
熱蓋105°C	on
4°C	1 min
30 °C	5-20 min**
72 °C	20 min
4°C	Hold

【注】：*DNA片段化過(guò)程為有效控制片段化效果，避免過(guò)度酶切，反應(yīng)程序可預(yù)先設(shè)置4°C，待模塊溫度降至4°C時(shí)，將PCR管放入PCR儀即可。**對(duì)于完整的基因組DNA，酶切時(shí)間參考表5。

表5  片段化時(shí)間選擇表

插入片段主峰大小	片段化時(shí)間
300~500 bp	5 min
250 bp	10 min
200 bp	15 min
150 bp	20~30 min

 圖2  不同片段化條件下的文庫(kù)峰形參考

 

Step 2 接頭連接（Adapter Ligation）

該步驟可在末端修復(fù)和dA尾添加的產(chǎn)物末端，連接特定的Illumina^®或者MGI^®接頭。

1. 參考注意事項(xiàng)二中的表1，根據(jù)Input DNA，稀釋Adapter至合適濃度。

2. 將表6中各試劑解凍后顛倒混勻，置于冰上備用。

3. 于Step 1步驟結(jié)束后的PCR管中繼續(xù)配制表6所示反應(yīng)體系。

表6 Adapter Ligation體系

名稱	體積（μL）
dA-tailed DNA	60
Ligation Enhancer	30*
Novel T4 DNA Ligase	5
DNA Adapter	5**
Total	100

【注】：*Ligation Enhancer使用前請(qǐng)上下顛倒、振蕩，充分混勻并瞬時(shí)離心后使用。
**本公司Illumina接頭原始濃度為15 μM, 請(qǐng)根據(jù)注意事項(xiàng)二表1提示，根據(jù)投入量對(duì)接頭進(jìn)行稀釋，使接頭添加體積固定為5 μL。

4. 使用移液器輕輕吹打混勻，并短暫離心將反應(yīng)液收集至管底。

5. 將PCR管置于PCR儀中，設(shè)置表7所示反應(yīng)程序，進(jìn)行接頭連接反應(yīng)：

表7 Adapter Ligation反應(yīng)程序

溫度	時(shí)間
熱蓋	Off
20°C	15 min
4°C	Hold

 

Step 3連接產(chǎn)物純化（Post Ligation Clean Up）

1. 準(zhǔn)備工作：將Hieff NGS^® DNA Selection Beads磁珠由冰箱中取出，室溫平衡至少30 min。配制80%乙醇。

2. 渦旋振蕩或充分顛倒磁珠以保證充分混勻。

3. 吸取45 μL Hieff NGS^® DNA Selection Beads（0.45×，Beads:DNA=0.45:1）至Adapter Ligation產(chǎn)物中，渦旋或吹打混勻，室溫孵育5 min。

4. 將PCR管短暫離心并置于磁力架中分離磁珠和液體，待溶液澄清后（約5 min），小心移除上清。

5. 保持PCR管始終置于磁力架中，加入200 μL新鮮配制的80%乙醇漂洗磁珠，室溫孵育30 sec后，小心移除上清。

6. 重復(fù)步驟5，總計(jì)漂洗兩次。

7. 保持PCR管始終置于磁力架中，用10 μL移液器吸干凈殘留液體，開蓋空氣干燥磁珠至剛剛出現(xiàn)龜裂（不超過(guò)5 min）。

8. 將PCR管從磁力架中取出，加入21 μL ddH₂O，渦旋振蕩或使用移液器輕輕吹打至充分混勻，室溫靜置5 min。將PCR管短暫離心并置于磁力架中靜置，待溶液澄清后（約3 min），小心移取20 μL上清至新PCR管中，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

 

Step 4 文庫(kù)擴(kuò)增（Library Amplification）

該步驟將對(duì)純化后的接頭連接產(chǎn)物進(jìn)行PCR擴(kuò)增富集。

1. 將表8中的試劑解凍后顛倒混勻，置于冰上備用。

2. 于無(wú)菌PCR管中配制表8所示反應(yīng)體系。
表8 短接頭連接產(chǎn)物PCR反應(yīng)體系（Illumina擴(kuò)增體系）

組分名稱	體積（μL）
2× Ultima HF Amplification Mix	25
Universal Primer/ i5 Primer*	2.5
Index Primer/ i7 Primer*	2.5
Adapter Ligated DNA	20
Total	50

【注】：*使用的是無(wú)Index的接頭，俗稱短接頭（小Y接頭），請(qǐng)使用短接頭試劑（Cat#12412~Cat#12413）中配備的Index primer進(jìn)行擴(kuò)增。

3. 使用移液器輕輕吹打或振蕩混勻，并短暫離心將反應(yīng)液收集至管底。

4. 將PCR管置于PCR儀中，設(shè)置表9示反應(yīng)程序，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

表9  PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序

溫度	時(shí)間	循環(huán)數(shù)
98°C	1 min	1
98°C	10 sec	參照注意事項(xiàng)三，文庫(kù)擴(kuò)增
60°C	30 sec
72°C	30 sec
72°C	1 min	1
4°C	Hold	-

 

Step 5 擴(kuò)增產(chǎn)物磁珠純化（Post Amplification Clean Up）

1. 準(zhǔn)備工作：將Hieff NGS^® DNA Selection Beads磁珠由冰箱中取出，室溫平衡至少30 min。配制80%乙醇。

2. 渦旋振蕩或充分顛倒磁珠以保證充分混勻。

3. 吸取45 μL Hieff NGS^® DNA Selection Beads（0.9×，Beads:DNA=0.9:1）至Adapter Ligation產(chǎn)物中，渦旋或吹打混勻，室溫孵育5 min。

4. 將PCR管短暫離心并置于磁力架中分離磁珠和液體，待溶液澄清后（約5 min），小心移除上清。

5. 保持PCR管始終置于磁力架中，加入200 μL新鮮配制的80%乙醇漂洗磁珠，室溫孵育30 sec后，小心移除上清。

6. 重復(fù)步驟5，總計(jì)漂洗兩次。

7. 保持PCR管始終置于磁力架中，用10 μL移液器吸干凈殘留液體，開蓋空氣干燥磁珠至剛剛出現(xiàn)龜裂（不超過(guò)5 min）。

8. 將PCR管從磁力架中取出，加入32 μL ddH₂O，渦旋振蕩或使用移液器輕輕吹打至充分混勻，室溫靜置5 min。將PCR管短暫離心并置于磁力架中靜置，待溶液澄清后（約3 min），小心移取30 μL上清至新PCR管中，進(jìn)行文庫(kù)定量、質(zhì)檢。

 

Step 6 文庫(kù)質(zhì)量控制

通常情況下，構(gòu)建好的文庫(kù)可通過(guò)濃度檢測(cè)和長(zhǎng)度分布檢測(cè)來(lái)進(jìn)行質(zhì)量評(píng)價(jià)，具體請(qǐng)參見注意事項(xiàng)五。

 

HB220810