Hieff NGS? C112P1 Fast Tagment DNA Library Prep Kit for Illumina? (for 1 ng)
批量采購， 請(qǐng)點(diǎn)擊詢價(jià)
產(chǎn)品說明書
FAQ
COA
已發(fā)表文獻(xiàn)
產(chǎn)品簡介
Hieff NGS® C112P1 Fast Tagment DNA Library Prep Kit for Illumina® (for1 ng)是針對(duì) lllumina®高通量測(cè)序平臺(tái)專業(yè)開發(fā)設(shè)計(jì)的轉(zhuǎn)座酶法建庫試劑盒，適用于1 ng的基因組 DNA、cDNA、擴(kuò)增子（>500 bp）等樣本的建庫。與常規(guī)分步法建庫相比，Hieff NGS® C112P1 Fast Tagment DNA Library Prep Kit for Illumina®采用新型轉(zhuǎn)座酶和優(yōu)化的緩沖體系，僅需10 min即可完成DNA片段化、末端修復(fù)和接頭連接過程，顯著縮短建庫時(shí)間至1.5小時(shí)以內(nèi)，并獲得優(yōu)異的測(cè)序質(zhì)量。此外，本試劑盒已經(jīng)不同GC含量DNA樣本的驗(yàn)證，無偏好性或僅具有極低的偏好性。本試劑盒提供的所有試劑盒組分，都經(jīng)過嚴(yán)格的質(zhì)量與功能驗(yàn)證，最高程度保障產(chǎn)品優(yōu)異性能與批間穩(wěn)定性。
組分信息
|
組分編號(hào) |
|
組分名稱 |
13468ES08 |
13468ES24 |
13468ES96 |
|
13468-A |
|
5×Reaction Buffer |
32 μL |
96 μL |
384 μL |
|
13468-B |
|
Transposome Mix V1 |
40 μL |
120 μL |
480 μL |
|
13468-C |
|
PCR Primer Mix |
24 μL |
72 μL |
288 μL |
|
13468-D |
|
2×Ultima Amplification Mix |
200 μL |
600 μL |
2×1200 μL |
|
13468-E |
|
T5 (T501)* |
8 μL |
—— |
—— |
|
13468-F |
|
T7 (T701)* |
4 μL |
—— |
—— |
|
13468-G |
|
T7 (T702)* |
4 μL |
—— |
—— |
注：*測(cè)序時(shí) Index 序列T501-CTCTCTAT（NovaSeq 6000 v1.0）或ATAGAGAG（NovaSeq 6000 v1.5），T701-TAAGGCGA，T702-CGTACTAG。
儲(chǔ)存條件
-25~-15℃保存，有效期1年。
注意事項(xiàng)
一、關(guān)于操作
1. 為了您的安全和健康，請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。
2. 請(qǐng)于使用前將試劑盒酶組分置于冰盒解凍，buffer組分置于室溫解凍。解凍后上下顛倒充分混勻，短離后置于冰上待用。
3. 配制各步驟反應(yīng)液時(shí)推薦使用移液器吹打混勻或輕輕振蕩，劇烈振蕩可能會(huì)造成文庫產(chǎn)出下降。
4. 為避免樣品交叉污染，推薦使用帶濾芯的槍頭，吸取不同樣品時(shí)請(qǐng)更換槍頭。
5. 推薦在帶熱蓋的PCR儀中進(jìn)行各步驟反應(yīng)，使用前應(yīng)預(yù)熱PCR儀至反應(yīng)溫度。
6. PCR產(chǎn)物因操作不當(dāng)極容易產(chǎn)生氣溶膠污染，進(jìn)而影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確性。推薦將PCR反應(yīng)體系配制區(qū)和PCR產(chǎn)物純化檢測(cè)區(qū)進(jìn)行強(qiáng)制性的物理隔離；使用專用的移液器等設(shè)備；并定時(shí)對(duì)各實(shí)驗(yàn)區(qū)域進(jìn)行清潔（使用0.5%次氯酸鈉或10%漂白劑進(jìn)行擦拭清理），以保證實(shí)驗(yàn)環(huán)境的潔凈度。
7. 本產(chǎn)品僅作科研用途！
二、關(guān)于產(chǎn)品原理
1. 本產(chǎn)品基于轉(zhuǎn)座酶法開發(fā)，其核心原理是轉(zhuǎn)座酶及其轉(zhuǎn)座機(jī)制。在Transposome Mix中包含由轉(zhuǎn)座酶和兩種等摩爾的接頭Adapter 1和Adapter 2構(gòu)成一個(gè)完整的轉(zhuǎn)座子。轉(zhuǎn)座發(fā)生時(shí)，該轉(zhuǎn)座子將Adapter 1和Adapter 2接頭序列插入靶基因中，形成一端帶有Adapter 1，一端帶有Adapter 2的DNA，之后利用DNA聚合酶將轉(zhuǎn)座形成的切口補(bǔ)齊。這種產(chǎn)物經(jīng)N5（N5XX）和N7（N7XX）以及P5和P7（PCR Primer Mix）兩對(duì)引物擴(kuò)增，產(chǎn)物經(jīng)分選和純化后即為可測(cè)序文庫。
圖1. Fast Tagment DNA建庫試劑盒原理
三、關(guān)于DNA片段化
1. 本試劑盒使用轉(zhuǎn)座酶進(jìn)行DNA片段化。如DNA樣品為PCR產(chǎn)物，應(yīng)保證其長度>500 bp。因轉(zhuǎn)座酶無法作用于DNA末端，因此PCR產(chǎn)物最末端50 bp測(cè)序覆蓋度可能會(huì)有所降低。我們推薦您在制備PCR產(chǎn)物時(shí)將待測(cè)區(qū)域兩末端各延長50-100 bp，以避免末端測(cè)序覆蓋度降低的情況。
2. 本試劑盒適用1 ngInput DNA。在Input DNA投入前，應(yīng)將其純化并溶于滅菌蒸餾水中，A260/A280 = 1.8-2.0，并使用基于雙鏈DNA熒光染料的方法，如 Qubit®、PicoGreen®等進(jìn)行定量。【注意：因Transposome Mix 對(duì)DNA濃度非常敏感，所以準(zhǔn)確的 DNA 濃度測(cè)定對(duì)實(shí)驗(yàn)成功與否至關(guān)重要?！?/font>
四、關(guān)于DNA磁珠純化與分選（Bead-based Clean Up and Size Selection）
1. 磁珠使用前應(yīng)先平衡至室溫，否則會(huì)導(dǎo)致得率下降、分選效果不佳。
2. 磁珠每次使用前都應(yīng)充分振蕩混勻或使用移液器上下吹打充分混勻。
3. 轉(zhuǎn)移上清時(shí)，請(qǐng)勿吸取磁珠，即使微量殘留都將影響后續(xù)文庫質(zhì)量。
4. 磁珠漂洗使用的80%乙醇應(yīng)現(xiàn)用現(xiàn)配，否則將影響回收效率。
5. 磁珠使用過程中，應(yīng)保證移液準(zhǔn)確性。
6. 產(chǎn)物洗脫前應(yīng)將磁珠置于室溫干燥。干燥不充分容易造成無水乙醇?xì)埩粲绊懞罄m(xù)反應(yīng)；過分干燥又會(huì)導(dǎo)致磁珠開裂進(jìn)而
降低純化得率。通常情況下，室溫干燥3-5 min足以讓磁珠充分干燥。
7.DNA 純化或長度分選產(chǎn)物如需保存，可使用0.1×TE Buffer 洗脫，產(chǎn)物于 4°C 可保存1 周，-20°C可保存1個(gè)月。
五、關(guān)于文庫擴(kuò)增（Library Amplification）
1. 使用本試劑盒必須進(jìn)行文庫擴(kuò)增步驟。因轉(zhuǎn)座反應(yīng)產(chǎn)物并非完整的雙鏈DNA文庫，必須通過PCR反應(yīng)生成完整的DNA文庫。
2. 當(dāng)Input DNA量為1 ng時(shí)，推薦使用 8-15個(gè)擴(kuò)增循環(huán)，13個(gè)循環(huán)的文庫產(chǎn)出約為600 ng。
六、關(guān)于文庫質(zhì)檢（Library Quality Analysis）
1. 通常情況下，構(gòu)建好的文庫可通過長度分布檢測(cè)和濃度檢測(cè)來進(jìn)行質(zhì)量評(píng)價(jià)。
2. 文庫濃度檢測(cè)可使用：基于雙鏈DNA熒光染料的方法，如Qubit®、PicoGreen®等；基于qPCR絕對(duì)定量的方法。
3. 推薦使用qPCR方法進(jìn)行文庫濃度檢測(cè)：Qubit®、PicoGreen®等基于雙鏈 DNA 熒光染料的濃度測(cè)定方法時(shí)，無法有效區(qū)分單端連接Adapter的產(chǎn)物、兩端均未連接Adapter的產(chǎn)物以及其他不完整雙鏈結(jié)構(gòu)產(chǎn)物；qPCR絕對(duì)定量基于PCR擴(kuò)增原理，僅定量樣品中兩端Adapter完整的文庫（即可測(cè)序的文庫），可排除單端或雙端都不連接Adapter的不可測(cè)序文庫的干擾。
4. 文庫濃度檢測(cè)不可使用：基于光譜檢測(cè)的方法，如NanoDrop®等。
5. 文庫長度分布檢測(cè)，可通過Agilent Bioanalyzer 2100等基于毛細(xì)管電泳或微控流原理的設(shè)備進(jìn)行檢測(cè)。
使用說明
一、自備材料
1. 純化磁珠：Cat#12601，Hieff NGS® DNA Selection Beads或Cat#A63880，AMPure XP Beads或其他等效產(chǎn)品。
2. DNA質(zhì)控：Agilent Technologies 2100 Bioanalyzer或其他等效產(chǎn)品。
3. N5（N5XX）和N7（N7XX）Index引物： Hieff NGS® Tagment Index Kit for Illumina® (96 Index)（Cat#12416ES96）。
4. 其他材料：無水乙醇、滅菌超純水、TE Buffer（10 mM Tris-HCl, pH 8.0-8.5; 0.1 mM EDTA）、低吸附EP管、PCR管、
磁力架、PCR儀等。
二、操作流程
圖. Fast Tagment DNA建庫試劑盒操作流程
三、操作步驟
3.1 DNA片段化（DNA Fragment）
1. 準(zhǔn)備工作：將 Hieff NGS® DNA Selection Beads 磁珠由冰箱中取出，室溫平衡至少30 min。配制80%乙醇。將5×Reaction Buffer室溫解凍后，顛倒混勻，置于冰上備用。
2. 于無菌PCR管中配制表 1 所示反應(yīng)體系。
表1 DNA片段化體系
|
名稱 |
體積（μL） |
|
1 ng Input DNA |
x |
|
5×Reaction Buffer |
4 |
|
Transposome Mix V1 |
5 |
|
ddH2O |
Up to 20 μL |
3. 使用移液器輕輕吹打或振蕩混勻，并短暫離心將反應(yīng)液離心至管底。
4. 將上述PCR管置于PCR儀，設(shè)置表2所示反應(yīng)程序，進(jìn)行DNA片段化反應(yīng)。
表2 DNA片段化反應(yīng)程序
|
溫度 |
時(shí)間 |
|
熱蓋105°C |
On |
|
55°C |
10 min |
|
4°C |
Hold |
3.2文庫擴(kuò)增 (Library Amplification)
1. 提前將表 3 中的試劑解凍混勻，置于冰上備用。
2. 片段化程序結(jié)束后，立即將 PCR 管置于冰上配制表 3 中 PCR 反應(yīng)體系。
|
名稱 |
體積 (μL) |
|
片段化產(chǎn)物 |
20 |
|
PCR Primer Mix* |
3 |
|
N5XX* |
1 |
|
N7XX* |
1 |
|
2×Ultima Amplification Mix |
25 |
|
ddH2O |
To 50 μL |
表3 PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系
注意：*Hieff NGS® Tagment Index Kit for Illumina® (96 Index)（Cat#12416ES96）中提供8種N5XX和12種N7XX，可根據(jù)樣品數(shù)量和Index選擇策略自行選擇。
3. 使用移液器輕輕吹打或振蕩混勻，并短暫離心將反應(yīng)液收集至管底。
4. 將PCR管置于PCR儀中，設(shè)置表4所示反應(yīng)程序，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。
表4 PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序
|
溫度 |
時(shí)間 |
循環(huán)數(shù) |
|
熱蓋105°C |
On |
|
|
72°C |
3 min* |
1 |
|
95°C |
30 sec |
1 |
|
95°C |
|
n cycles**
|
|
55°C |
30 sec |
|
|
72°C |
30 sec |
|
|
72°C |
5 min |
1 |
|
4°C |
Hold |
- |
【注意】：*此步不可省略。轉(zhuǎn)座反應(yīng)產(chǎn)物并非完整的雙鏈DNA，72℃孵育3 min用于生成成熟的PCR模板。
**循環(huán)數(shù)請(qǐng)根據(jù)測(cè)序需要進(jìn)行選擇。起始DNA量為1 ng時(shí)，推薦8-15個(gè)擴(kuò)增循環(huán)。
3.3文庫純化或分選 （Library Clean UP/Size Selection）
如對(duì)文庫長度分布無特殊要求，可直接使用1.0×磁珠純化擴(kuò)增產(chǎn)物，而不進(jìn)行片段分選。如需進(jìn)行片段分選，則進(jìn)行以下
步驟，推薦使用Cat#12601 DNA Selection Beads 進(jìn)行產(chǎn)物片段分選，為防止接頭或大片段殘留，可進(jìn)行兩次片段分選，或先使用1.0×磁珠純化擴(kuò)增產(chǎn)物后再進(jìn)行分選。
1. 將平衡至室溫的 Hieff NGS® DNA Selection Beads 磁珠，振蕩或上下顛倒混勻。
2. 根據(jù)DNA片段長度要求，進(jìn)行雙輪分選時(shí)，需將初始DNA樣本用滅菌蒸餾水補(bǔ)齊至100 μL，參考表 5 推薦比例向文庫上清中加入第一輪分選磁珠，渦旋混勻或移液器吹打10次混勻，室溫孵育5 min?！咀⒁猓阂騊CR過程中樣品揮發(fā)會(huì)導(dǎo)致產(chǎn)物體積不足50 μL，進(jìn)行下面操作之前必須使用滅菌蒸餾水將體積補(bǔ)齊至100 μL，否則分選長度會(huì)與預(yù)期不一致?！?/font>
|
文庫平均總長度 |
~300 bp |
~400 bp |
~500 bp |
~800 bp |
|
第一輪磁珠用量 |
80 μL (0.8×) |
70 μL (0.7×) |
60 μL (0.6×) |
50 μL (0.5×) |
|
第二輪磁珠用量 |
20 μL (0.2×) |
20 μL (0.2×) |
20 μL (0.2×) |
15 μL (0.15×) |
表5 磁珠文庫分選推薦比例
【注意】：“×”數(shù)均根據(jù) PCR 產(chǎn)物體積補(bǔ)齊至 100 μL 計(jì)算而得，如“0.6×”表示 0.6×100 μL = 60 μL。
3. 將PCR管短暫離心并置于磁力架中，待溶液澄清后（約5 min），小心轉(zhuǎn)移上清到干凈的離心管中。
4. 參考表5向上清中加入第二輪分選磁珠。
7. 渦旋混勻或移液器吹打10次混勻，室溫靜置 5 min。
8. 將PCR管短暫離心并置于磁力架中，待溶液澄清后（約 5 min），小心移除上清。
9. 保持PCR管始終處于磁力架中，加入200 μL新鮮配制的80%乙醇漂洗磁珠，室溫孵育 30 sec，小心移除上清。
10. 重復(fù)步驟9，總計(jì)漂洗兩次。
11. 保持PCR管始終處于磁力架中，開蓋干燥磁珠至剛剛出現(xiàn)龜裂（約 5 min）。
12. 將PCR管從磁力架中取出，加入適量21 μL ddH2O，渦旋振蕩或使用移液器輕輕吹打充分混勻，室溫靜置5 min。
13. 將PCR管短暫離心并置于磁力架中分離磁珠和液體。待溶液澄清后（約5 min），小心轉(zhuǎn)移20 μL上清至干凈的管中，于-20℃保存。此外，如需獲得長度分布更集中的文庫擴(kuò)增產(chǎn)物，可使用膠回收方式進(jìn)行長度分選和純化；如對(duì)文庫長度分布范圍等無特殊要求，擴(kuò)增產(chǎn)物也可不進(jìn)行長度分選，直接使用磁珠或柱純化試劑盒進(jìn)行純化。
3.4 文庫質(zhì)量控制
通常情況下，構(gòu)建好的文庫可通過濃度檢測(cè)和長度分布檢測(cè)來進(jìn)行質(zhì)量評(píng)價(jià)，具體請(qǐng)參見注意事項(xiàng)六。
3.5 參考實(shí)例
使用 Hieff NGS® Fast Tagment DNA Library Prep Kit for Illumina®對(duì)1 ng嗜鹽桿菌gDNA樣本建庫，并分別使用1.0×磁珠進(jìn)行純化，0.8×/0.2×、0.7×/0.2×、0.5×/0.15×磁珠比例進(jìn)行長度分選，結(jié)果使用Agilent 2100 Bioanalyzer進(jìn)行檢測(cè)。
圖3 Agilent 2100 Bioanalyzer文庫質(zhì)量分析
