Hieff^® Fast T4 DNA Ligase是一款可用于NGS建庫過程中DNA片段和接頭連接的單酶產(chǎn)品，該產(chǎn)品已經(jīng)過高通量測(cè)序驗(yàn)證，質(zhì)量優(yōu)異。本酶具有高效的連接能力，非常適合復(fù)雜結(jié)構(gòu)核酸片段的連接，比如華大平臺(tái)的Ω接頭。對(duì)于無需進(jìn)行體系調(diào)整的客戶，推薦選購Hieff NGS^® Ultima DNA Ligation Module (Cat#12604)，其核心組分即為本品。
 

產(chǎn)品組分

組分編號(hào)	組分名稱	產(chǎn)品編號(hào)/規(guī)格
		10299ES40 （40000 U）	10299ES42 （400000 U）	10299ES83 （1600 KU）	10299ES08 （5 mL）
10299-A	Hieff® Fast T4 DNA Ligase (400 U/µL)	100 µL	1 mL	4 mL	5 mL
10299-B	10 × T4 DNA Ligase Buffer	250 μL	5 × 500 μL	10 mL	12.5 mL

單位定義

在20 μL的連接反應(yīng)體系中，6 μg的λDNA-Hind Ⅲ分解物在16℃下反應(yīng)30 min時(shí)，催化50%以上的DNA片段發(fā)生連接所需要的酶量定義為1個(gè)活性單位(U)。

運(yùn)輸與保存方法

冰袋運(yùn)輸。-20℃保存，有效期2年。

注意事項(xiàng)

1. T4 DNA Ligase對(duì)物理變性敏感，混合時(shí)輕輕顛倒試管搖勻，請(qǐng)勿劇烈振蕩；

2. 酶使用時(shí)宜存放在冰盒內(nèi)或冰浴上，使用完畢后宜立即放置于-20℃保存；

3. 本產(chǎn)品僅做科研用途；

4. 為了您的安全和健康，請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。

 

使用方法

1. 目前主流的合并法DNA建庫試劑盒，其末端修復(fù)和加A處理后一般不純化，直接進(jìn)行接頭連接。本試劑盒可與主流的商業(yè)化末端修復(fù)加A體系兼容，進(jìn)行接頭連接。反應(yīng)體系請(qǐng)參考如下配制，渦旋瞬離后置于20℃，反應(yīng)15 min即可。

表1  Adapter Ligation體系

名稱	體積（μL）
dA-tailed DNA	60
10 × T4 DNA Ligase Buffer	10
50% PEG 6000	10*
DNA Adapter	X**
Hieff® Fast T4 DNA Ligase (400 U/µL)	1-5***
ddH2O	To 100

【注】：*試劑盒內(nèi)未提供50% PEG 6000，需自行準(zhǔn)備。

**接頭用量參考表2。

***Hieff^® Fast T4 DNA Ligase用量可根據(jù)需要添加1-5 μL。

2. Adapter的質(zhì)量和使用濃度直接影響連接效率及文庫產(chǎn)量。Adapter用量過高可能會(huì)產(chǎn)生較多Adapter Dimer；用量較低可能會(huì)影響連接效率及文庫產(chǎn)量。表2列舉了使用本試劑盒，不同Input DNA量推薦的Adapter使用量。

表2  500 pg-1 μg Input DNA推薦的Adapter使用濃度

Input DNA	Adapter : Input DNA摩爾比	Input DNA	Adapter : Input DNA摩爾比
1 μg	10:1	50 ng	100:1
500 ng	20:1	25 ng	200:1
250 ng	40:1	1 ng	200:1
100 ng	100:1	500 pg	400:1

【注】：Input DNA摩爾數(shù)（pmol）≈ Input DNA質(zhì)量(ng)/ [0.66 × Input DNA平均長度（bp）]。

【接頭添加計(jì)算舉例】：當(dāng)Input DNA為100 ng，Input DNA長度為300 bp時(shí)，接頭應(yīng)該添加多少？

第一步，計(jì)算Input DNA摩爾數(shù)。公式：Input DNA摩爾數(shù)（pmol）≈ Input DNA質(zhì)量(ng)/ [0.66 × Input DNA平均長度（bp）]；

Input DNA摩爾數(shù)（pmol）=100 ÷（0.66×300）=0.5 pmol；

第二步，計(jì)算接頭添加摩爾數(shù)。根據(jù)表2查詢接頭添加比例；

根據(jù)表2，查得Input DNA 100ng時(shí)接頭添加比例100:1，則接頭添加摩爾數(shù)=100×0.5 pmol=50 pmol；

第三步，計(jì)算接頭添加體積。接頭濃度=15 μmol/L（如使用其他接頭，濃度需要依據(jù)其他接頭濃度參數(shù)）；

接頭添加體積=接頭添加摩爾數(shù)（50 pmol）÷接頭濃度（15 μmol/L）=3.34 μL（注：15 μmol/L=15 pmol/μL）

綜上，接頭可添加3.4 μL。（注：接頭最大加入體積不超過5 μL）

HB220930