本產(chǎn)品將LAMP可視光染料整合到buffer中，buffer中含dATP、dCTP、dGTP和dUTP等Bst II DNA Polymerase擴(kuò)增必須的組分，同時包含pH 敏感指示劑，試劑盒含有無甘油Bst II DNA Polymerase、UDGase、RT enzyme等，可用于凍干反應(yīng)體系的配制；同時減少了加樣操作，降低操作誤差，在極大程度上抑制假陽性反應(yīng)，提高檢測的準(zhǔn)確度。本試劑盒具有較高的擴(kuò)增效率和靈敏度，擴(kuò)增結(jié)果可肉眼判斷，陽性反應(yīng)孔為橙黃色，陰性反應(yīng)孔為洋紅色，反差極大。

 

產(chǎn)品組分

組分編號	組分名稱	產(chǎn)品編號/規(guī)格
		13906ES65 (100 T)	13906ES80 (1000 T)	13906ES92 (10000 T)
13906-A	2.5×pH Sensitive Reation Buffer	1 mL	10 mL	100 mL
13906-B	無甘油RT酶Mix	30 μL	300 μL	3 mL
13906-C	無甘油Bst酶	50 μL	500 μL	5 mL

 

運輸和保存方法

Part I：組分13906-A【2.5×pH Sensitive Reation Buffer】干冰運輸，-20°C保存，有效期6個月。

Prat II：組分13906-B\C【無甘油RT酶Mix\Bst酶】冰袋運輸，4°C保存，有效期6個月。

 

注意事項

1. 使用本試劑前請仔細(xì)閱讀說明書。

2. 整個實驗，應(yīng)規(guī)范操作，包括反應(yīng)體系的配制、樣本處理及加樣。

3. 為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。

 

使用方法

1. 待檢樣本準(zhǔn)備

核酸提取后樣本：直接作為模板，加入反應(yīng)體系中。

煮沸法：臨床采集的拭子樣本直接放入水中，置于95°C水浴鍋或金屬浴中進(jìn)行5 min的熱裂解，釋放核酸，混勻后即可作為模板加入反應(yīng)體系中。

【注】：1）處理樣本的試劑不能使用強酸或強堿的核酸釋放劑，若必須使用，則樣本處理完后，需將樣本的pH調(diào)節(jié)至8.0。

2）加入的樣本中，避免使用Tris-HCl等高濃度的緩沖體系，避免pH指示劑不能發(fā)生變色，影響實驗結(jié)果判讀。

2. 反應(yīng)體系

將A組分從-20°C取出，溶解后顛倒混勻，瞬時離心確保所有液體落到管底。根據(jù)待檢測樣品量，配制如下體系（通常實驗需要設(shè)置陰性對照和陽性對照）：

組分	單次反應(yīng)體積（μL）	終濃度
2.5×pH Sensitive Reation Buffer	10	1×
Bst酶	0.5	0.32 U/µL
RT酶Mix	0.3	-
10×Primers 2	2.5	1×
模板3	10 ng-1 µg	-
加ddH2O至	25	-

【注】：

1）陰性對照推薦設(shè)置空白（不加模板）對照以及NTC（一般為水）對照。

2）10×Primers：16 µM FIP/BIP，2 µM F3/B3，4 µM Loop F/B each。

3）模板加入量在1-8 µL內(nèi)調(diào)整；推薦模板RNA溶解于DEPC水中。

3. 加樣

1）如果反應(yīng)是在水浴鍋中進(jìn)行，則每管加入20 μL礦物油（自備），以防止液體蒸發(fā)導(dǎo)致結(jié)果的誤差。如果反應(yīng)是在PCR儀中進(jìn)行，不需要加礦物油（請開啟熱蓋）。

2）為避免污染，建議用戶在超凈臺中配制組分，在其他房間的通風(fēng)櫥中加入模板以免出現(xiàn)假陽性結(jié)果。

3）由于本試劑使用的是pH指示劑法，該試劑中的緩沖液能力較弱，試劑不可長期接觸空氣，否則會吸附空氣中的二氧化碳致使試劑變酸，導(dǎo)致試劑顏色變淺，影響實驗結(jié)果判讀。

4. 反應(yīng)條件

溫度	時間	作用
25-37°C	2-5 min	降解含U模板
60-65°C	30 min	恒溫擴(kuò)增
85°C	5 min	失活

【注】：

1）本試劑盒所用酶對溫度非常敏感，強烈建議使用PCR儀操作；如用水浴鍋，應(yīng)先加熱使其達(dá)到規(guī)定溫度后再反應(yīng)。溫差超過2°C，將導(dǎo)致擴(kuò)增效率降低，使陽性反應(yīng)無法在說明書規(guī)定的時間內(nèi)洋紅色變成橙黃色。

2）反應(yīng)溫度需要根據(jù)引物的Tm值進(jìn)行調(diào)整。

3）反應(yīng)時間依據(jù)模板濃度而定，低濃度模板可能需要60 min時間才能有比較明顯的反應(yīng)。

5. 結(jié)果判斷

反應(yīng)30 min后，立刻取出反應(yīng)管，待降溫至室溫后，置于光線良好的環(huán)境中觀察（建議以白紙作為背景）。如反應(yīng)液為洋紅色，則為陰性結(jié)果；如反應(yīng)液為橙黃色則為陽性結(jié)果。

【注】：反應(yīng)的時間必須準(zhǔn)確計時，超過說明書規(guī)定的反應(yīng)時間可能會出現(xiàn)假陽性。反應(yīng)管不可開蓋，否則會污染，影響后續(xù)實驗。

 

HB220518