本產(chǎn)品將LAMP可視光染料整合到buffer中，buffer中含dATP、dCTP、dGTP和dUTP等Bst II DNA Polymerase擴(kuò)增必須的組分，同時(shí)包含pH敏感指示劑，試劑盒含有無甘油Bst II DNA Polymerase、UDGase、RT enzyme等，可用于凍干反應(yīng)體系的配制，同時(shí)含有凍干保護(hù)劑，可以直接上凍干機(jī)凍干。本試劑具有較高的擴(kuò)增效率和靈敏度，擴(kuò)增結(jié)果可肉眼判斷，陽性反應(yīng)孔為橙黃色，陰性反應(yīng)空為洋紅色，反差極大。

 

產(chǎn)品組分

組分編號(hào)	組分名稱	產(chǎn)品編號(hào)/規(guī)格
		13920ES60 (100 T)	13920ES80 (1000 T)	13920ES92 (10000 T)
13920-A	2.5×pH Sensitive Reation Buffer	1 mL	10 mL	100 mL
13920-B	無甘油RT酶Mix	50 μL	500 μL	5 mL
13920-C	無甘油Bst酶	30 μL	300 μL	3 mL
13920-D	凍干保護(hù)劑	500 μL	5 mL	50 mL

 

運(yùn)輸與保存方法

Part I：組分13920-A/D【2.5×pH Sensitive Reation Buffer/凍干保護(hù)劑】干冰運(yùn)輸，-20°C保存，有效期6個(gè)月。

Prat II：組分13920-B/C【無甘油RT酶Mix/Bst酶】冰袋運(yùn)輸，4°C保存，有效期3個(gè)月。

 

注意事項(xiàng)

1. 使用本試劑前請(qǐng)仔細(xì)閱讀說明書。

2. 整個(gè)實(shí)驗(yàn)，應(yīng)規(guī)范操作，包括反應(yīng)體系的配制、樣本處理及加樣。

3. 為了您的安全和健康，請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。

 

使用方法

1. 待檢樣本準(zhǔn)備

核酸提取后樣本：直接作為模板，加入反應(yīng)體系中。

煮沸法：臨床采集的拭子樣本直接放入水中，置于95°C水浴鍋或金屬浴中進(jìn)行5 min的熱裂解，釋放核酸，混勻后即可作為模板加入反應(yīng)體系中。

【注】：

1）處理樣本的試劑不能使用強(qiáng)酸或強(qiáng)堿的核酸釋放劑，若必須使用，則樣本處理完后，需將樣本的pH調(diào)節(jié)至8.0。

2）加入的樣本中，避免使用Tris-HCl等高濃度的緩沖體系，避免pH指示劑不能發(fā)生變色，影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果判讀。

 

2. 凍干上機(jī)反應(yīng)體系配置

將A組分從-20°C取出，溶解后顛倒混勻，瞬時(shí)離心確保所有液體落到管底。根據(jù)待檢測(cè)樣品量，配制如下體系（通常實(shí)驗(yàn)需要設(shè)置陰性對(duì)照和陽性對(duì)照）：

組分	單次反應(yīng)體積（μL）	終濃度
2.5×pH Sensitive Reation Buffer	10	1×
Bst酶	0.3-1.2	0.32U/μL-1.28U/μL
RT酶Mix	0.5	-
10×Primers a	2.5	1×
凍干保護(hù)劑	5	-

a【注】：不同引物的最適Bst 酶用量不同，更換引物建議按照推薦的酶量梯度篩選最適酶用量。

 

3. 凍干上機(jī)

3.1 輔料配方發(fā)生微量的變化，需重新測(cè)定凍干參數(shù)，并做相應(yīng)調(diào)整。

3.2 各組份使用前充分混勻，避免劇烈震蕩產(chǎn)生過多氣泡。反應(yīng)體系配制好后，建議震蕩5-10 s后瞬時(shí)離心再上機(jī)。凍干粉8聯(lián)排管蓋為凍干試劑制備專用，上機(jī)時(shí)請(qǐng)更換普通8 聯(lián)排管蓋。

3.3 凍干設(shè)備要求：

冷阱盤管表面溫度≤-60°C

板層溫度≤-45°C，溫度均一性±1°C（性能詳細(xì)說明及驗(yàn)證方案咨詢翌圣生物技術(shù)人員）

可做壓升測(cè)試（凍干生產(chǎn)前，做泄漏率測(cè)試）

3.4 環(huán)境要求：

溶液分裝及配置盡量在萬級(jí)層流保護(hù)下進(jìn)行，環(huán)境空間塵埃掉落進(jìn)溶液中成為凍干過程的晶核，影響溶液的結(jié)晶的過冷度，導(dǎo)致產(chǎn)品質(zhì)量不一致性。

3.5 真空控制

摻氣方式：建議摻入氣體為高純氮?dú)?/font>

3.6 凍干試劑 MIX 工藝參數(shù)設(shè)定參考（凍干設(shè)備升華效率≥1mm/小時(shí)）

		溫度	斜率時(shí)間	時(shí)間	真空 Pa	備注
預(yù)凍	1	-45°C	——	2 h	——	常溫最快速率降溫
	2	-45°C	——	——	——	保持，根據(jù)包材驗(yàn)證保持時(shí)間
真空	3	-45°C	——	——	15
升華階段	4	-40°C		10 h	15	無斜率控制型凍干機(jī)，可分6個(gè)階段升溫
	5	0°C	2 h	0 h	15
	6	25°C	2 h	4 h	15
解析干燥	7	30°C	——	2 h	0
含水量控制	8	壓升測(cè)試重試時(shí)間：30 min				壓升測(cè)試：2 min<5 Pa

3.7 實(shí)驗(yàn)過程中請(qǐng)使用RNase free耗材。

3.8 為了您的安全和健康，請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并佩戴一次性手套操作。

 

4.凍干粉使用

組分	單次反應(yīng)體積（μL）	終濃度
DEPC H2O 復(fù)溶	20	1×
模板	5	-

【注】： 1）各組份使用前充分混勻，避免劇烈震蕩產(chǎn)生過多氣泡。反應(yīng)體系配制好后，建議震蕩5-10 s后瞬時(shí)離心再上機(jī)；                          

2）凍干粉8聯(lián)排管蓋為凍干試劑制備專用，上機(jī)時(shí)請(qǐng)更換普通8 聯(lián)排管蓋。

 

5. 反應(yīng)孔設(shè)置：

1）陰性對(duì)照推薦設(shè)置空白（不加模板）對(duì)照以及NTC（一般為水）對(duì)照。

2）10×Primers：16 µM FIP/BIP，2 µM F3/B3，4 µM Loop F/B each。

3）模板加入量在1-8 µL內(nèi)調(diào)整；推薦模板DNA溶解于去離子水中。

 

6. 加樣

1）如果反應(yīng)是在水浴鍋中進(jìn)行，則每管加入20 μL礦物油（自備），以防止液體蒸發(fā)導(dǎo)致結(jié)果的誤差。如果反應(yīng)是在PCR儀中進(jìn)行，不需要加礦物油（請(qǐng)開啟熱蓋）。

2）為避免污染，建議用戶在超凈臺(tái)中配制組分，在其他房間的通風(fēng)櫥中加入模板以免出現(xiàn)假陽性結(jié)果。

3）由于本試劑使用的是pH指示劑法，該試劑中的緩沖液能力較弱，試劑不可長期接觸空氣，否則會(huì)吸附空氣中的二氧化碳致使試劑變酸，導(dǎo)致試劑顏色變淺，影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果判讀。

 

7. 反應(yīng)條件

溫度	時(shí)間	作用
25-37°C	2-5 min	降解含U模板
60-65°C	30 min	恒溫?cái)U(kuò)增
85°C	5 min	失活

【注】：

1）本試劑盒所用酶對(duì)溫度非常敏感，強(qiáng)烈建議使用PCR儀操作；如用水浴鍋，應(yīng)先加熱使其達(dá)到規(guī)定溫度后再反應(yīng)。溫差超過2°C，將導(dǎo)致擴(kuò)增效率降低，使陽性反應(yīng)無法在說明書規(guī)定的時(shí)間內(nèi)洋紅色變成橙黃色。

2）反應(yīng)溫度需要根據(jù)引物的Tm值進(jìn)行調(diào)整。

3）反應(yīng)時(shí)間依據(jù)模板濃度而定，低濃度模板可能需要60 min時(shí)間才能有比較明顯的反應(yīng)。

 

8. 結(jié)果判斷

反應(yīng)30 min后，立刻取出反應(yīng)管，待降溫至室溫后，置于光線良好的環(huán)境中觀察（建議以白紙作為背景）。如反應(yīng)液為洋紅色，則為陰性結(jié)果；如反應(yīng)液為橙黃色則為陽性結(jié)果。

【注】：反應(yīng)的時(shí)間必須準(zhǔn)確計(jì)時(shí)，超過說明書規(guī)定的反應(yīng)時(shí)間可能會(huì)出現(xiàn)假陽性。反應(yīng)管不可開蓋，否則會(huì)污染，影響后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

HB221114