蛋白純化是將目標(biāo)蛋白從實驗樣本的總蛋白中分離出來，同時仍保留目的蛋白的生物學(xué)活性及化學(xué)完整性。選擇合適的標(biāo)簽不但有利于蛋白的純化，促進蛋白的可溶性，同時也不能影響蛋白的結(jié)構(gòu)功能和下游應(yīng)用。以下簡單列舉幾個常見蛋白標(biāo)簽：

表1. 不同蛋白純化標(biāo)簽介紹

Ni-NTA/TED Agarose Resin是以高度交聯(lián)的6%瓊脂糖凝膠為基質(zhì)，通過化學(xué)方法偶聯(lián)NTA/TED為配體，螯合鎳離子（Ni2+）而制備成的一種介質(zhì)。

表2 不同配體所構(gòu)成填料的性能比較

Ni-TED Agarose Resin 6FF測試：

1.樣品：菌液超聲破碎離心后的上清，過濾后純化

2.純化方式：裝5 mL,重力柱純化

3.純化方式：上樣2次

洗雜方式：10 mM咪唑洗雜100 mL

洗脫方式：30 mM咪唑洗雜30 mL；50 mM咪唑洗雜30 mL；250 mM咪唑洗雜30 mL。

圖1. Ni-TED Agarose Resin 6FF純化效果圖

HisSep Ni-NTA Agarose Resin測試：

1.某知名品牌his純化產(chǎn)品；

2.大量生產(chǎn)的FF高流速產(chǎn)品；

3.小樣生產(chǎn)的FF高流速產(chǎn)品；

4.his樹脂（20502ES）；

緩沖液：各個處理組均為1ml樹脂純化200 ml菌液；洗雜使用25mM的咪唑，洗脫液為250mM的咪唑。

His純化樹脂結(jié)合效率測試，與市場知名品牌進行對比，Yeasen研發(fā)的20502ES  HisSep Ni-NTA Agarose Resin （4號）具有良好的結(jié)合效率。如下圖：

圖2. HisSep Ni-NTA Agarose Resin純化效果圖

1.His標(biāo)簽是否丟失 

大腸桿菌表達外源蛋白過程中，常出現(xiàn)序列丟失的現(xiàn)象，若是標(biāo)簽丟失，蛋白自然就無法掛柱了?？刹捎肳estern-Blot方法通過His抗體檢測目標(biāo)蛋白是否存在His標(biāo)簽。若可以檢測得His-tag，那么就有可能與蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)有關(guān)，標(biāo)簽被“包埋”而暴露不出來了，這樣自然也是無法掛柱的?？梢試L試一下把該標(biāo)簽構(gòu)建于該蛋白質(zhì)的另外一端，比如 原來是在N端的，改為在C端；

2.His標(biāo)簽是否暴漏在融合蛋白表面，可通過蛋白中適量的加入尿素或鹽酸胍等變性劑，如可以掛柱，說明標(biāo)簽暴漏不充分，可嘗試變性純化。若因?qū)嶒灢荒茏冃裕荒車L試改變上游條件，要么增加his長度，提高標(biāo)簽暴漏機率，要么修改his標(biāo)簽位置。

3.另外請確認(rèn)一下層析buffer，別搞錯了平衡液和洗脫液，同時再確認(rèn)一下洗脫液的配方是否 正確，如果使用咪唑進行洗脫的，其濃度是否足夠了，一般最高用到500mM。

4.增加孵育時間

1.蛋白掛柱洗不下來是因為洗脫條件太溫和沒有破壞蛋白掛柱的結(jié)合力造成的

2.HIS標(biāo)簽蛋白純化出來不純怎么解決？

樣品中含有填料不能耐受的還原劑，導(dǎo)致Ni的脫落。

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