準(zhǔn)確的文庫定量分析對獲得高質(zhì)量測序數(shù)據(jù)十分關(guān)鍵。如果文庫定量濃度偏高，則可能由于成簇不足導(dǎo)致測序數(shù)據(jù)產(chǎn)量少；而定量濃度偏低則可能簇間信號干擾導(dǎo)致產(chǎn)生低質(zhì)量的數(shù)據(jù)，甚至導(dǎo)致測序失??；另外，隨著測序儀測序通量的提升，往往會將多個文庫合并到一起進(jìn)行測序，需要按照測序數(shù)據(jù)量的要求，根據(jù)定量結(jié)果混合相應(yīng)摩爾量的文庫，以穩(wěn)定產(chǎn)出各樣本數(shù)據(jù)量，因此文庫的精準(zhǔn)定量至關(guān)重要。
NGS中的定量主要有兩大系統(tǒng)，分別為基于實(shí)時(shí)熒光定量的qPCR和基于熒光光譜的Qubit定量方法。這兩種方法都可以進(jìn)行相對準(zhǔn)確的文庫濃度檢測，但在實(shí)際應(yīng)用中仍然存在一些差異。
Qubit定量 | qPCR文庫定量 | |
特異性 | 熒光染料優(yōu)先結(jié)合dsDNA | 僅測量同時(shí)含有P5端和P7端接頭的完整文庫片段 |
DNA片段長度 | 無特定限制 | ~300~450bp |
準(zhǔn)確度 | 高 | 非常高 |
其實(shí)樣本量要求 | 1-20μl稀釋樣本 | 2μl~9μl稀釋樣本 |
檢測濃度區(qū)間 | 0.2-100ng | 20 pM-0.0002 pM(視標(biāo)準(zhǔn)品濃度范圍而定） |
標(biāo)準(zhǔn)品數(shù)量 | 一般為2個 | 一般為6個 |
實(shí)驗(yàn)手動操作時(shí)間 | 設(shè)置時(shí)間5min，單個樣本測量時(shí)間3s， | ~30min(96孔板） |
檢測時(shí)間 | 5min-30min（視樣本量而定） | ~90min |
適用儀器 | Qubit（3.0/4.0）；有相應(yīng)波長的酶標(biāo)儀 | 熒光定量PCR儀 |
適用場景 | dsDNA定量；NGS文庫構(gòu)建過程中的dsDNA定量，常規(guī)文庫快遞定量 | 上機(jī)文庫pooling前精準(zhǔn)定量；珍貴樣本文庫定量；PCR-free文庫定量；FFPE文庫定量 |
優(yōu)勢 | 快速，準(zhǔn)確；文庫構(gòu)建過程中各反應(yīng)階段樣本量監(jiān)測的首選； 可定量樣本中的所有核酸類型； | 精準(zhǔn)；可區(qū)分單雙鏈，文庫長度檢測準(zhǔn)確，上機(jī)測序文庫結(jié)構(gòu)完整，覆蓋度準(zhǔn)確，測序數(shù)據(jù)DUP率低；多樣本檢測優(yōu)選； |
Qubit定量
1. 定量原理
Qubit的原理是利用熒光染料結(jié)合在DNA分子上發(fā)出熒光，再對熒光強(qiáng)度進(jìn)行測定從而得到核酸的濃度。熒光染料只有在與DNA雙鏈結(jié)合后才發(fā)出熒光，且所產(chǎn)生的熒光與DNA濃度呈正比。
2. 產(chǎn)品性能
即用型，5min實(shí)現(xiàn)準(zhǔn)確定量
基于dsDNA HS Assay Kit for Qubit? 試劑盒研發(fā)的1×dsDNA HS Assay Kit for Qubit?，是一款即用型的Qubit預(yù)混液，將原有試劑盒中高濃度的濃縮染料預(yù)先稀釋成工作液，操作的時(shí)候僅需將工作液與待測樣本混勻即可通過Qubit? 熒光儀測定樣本濃度，使用更方便。
產(chǎn)品特點(diǎn)
簡便易操作：即用型預(yù)混液，無需配制工作液，操作簡單，定量更省時(shí)
超高的靈敏度：64x梯度稀釋精準(zhǔn)定量，0.2 -100 ng dsDNA具有良好線性關(guān)系
超強(qiáng)的特異性：特異性檢測dsDNA，對一些常規(guī)污染物具有極好的耐受性
染料結(jié)合速度快：2 min 內(nèi)即可達(dá)到飽和，快速讀取準(zhǔn)確定量結(jié)果不用等
極高的穩(wěn)定性：熒光信號持續(xù)3h，常溫防止20d不影響定量準(zhǔn)確性
圖1. 產(chǎn)品穩(wěn)定性測試結(jié)果室溫存放2周仍保持穩(wěn)定（測定值與理論值偏差<10%）
注：測試方法，選取2個濃度的dsDNA，分別使用4℃存放的Thermo#Q33230、4℃存放的Yeasen#12642、室溫存放（約25℃）的Yeasen#12642在不同時(shí)間測定濃度值，每次測定值與第一次（記為0d）測定值計(jì)算偏差率。
圖2.產(chǎn)品穩(wěn)定性測試，超強(qiáng)穩(wěn)定性，有效期內(nèi)測試結(jié)果相關(guān)性高
3. 更簡捷的操作流程
Qubit定量產(chǎn)品推薦
翌圣類型 | 產(chǎn)品名稱 | 貨號 | 規(guī)格 | 用途及應(yīng)用場景 |
Qubit定量 | 12642ES60 | 100 T | ü dsDNA定量 ü 文庫定量 | |
12642ES76 | 500 T | |||
12640ES60 | 100 T | |||
12640ES76 | 500 T |
qPCR定量
1. 定量原理
qPCR法利用熒光檢測技術(shù)與PCR技術(shù)相結(jié)合，在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，通過實(shí)時(shí)監(jiān)測整個PCR過程中熒光信號的變化情況，反映濃度的變化，最后通過已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算未知樣品的濃度，以達(dá)到準(zhǔn)確定量文庫濃度。
由于其特異性引物僅會定量兩端接頭連接完整的文庫，可排除單端或雙端都不連接接頭的不可測序文庫的干擾，因此qPCR法作為文庫定量的金標(biāo)準(zhǔn)，準(zhǔn)確性最高。
2. 產(chǎn)品性能
本產(chǎn)品是用于 Illumina? 平臺高通量測序文庫濃度絕對定量的專用試劑盒，提供定量所需的DNA標(biāo)準(zhǔn)品、qPCR Master Mix、定量擴(kuò)增引物和參比染料ROX。其中，DNA標(biāo)準(zhǔn)品包含經(jīng)梯度稀釋的六份420bp的雙鏈DNA片段溶液，濃度為20pM-0.0002pM；擴(kuò)增引物對根據(jù)NGS文庫接頭序列P5和P7設(shè)計(jì)，可保證特異性擴(kuò)增雙端接頭完整的文庫分子；qPCR MasterMix是基于抗體法熱啟動的染料法qPCR預(yù)混液，可在不同長度、不同GC或AT含量樣本中高效、特異擴(kuò)增。
產(chǎn)品特點(diǎn)
精準(zhǔn)定量：精準(zhǔn)定量完整測序文庫，提高測序數(shù)據(jù)質(zhì)量
適用性廣：穩(wěn)定有效的定量不同長度、不同GC含量的文庫
便捷使用：試劑盒中包含ROX，方便qPCR儀器進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化
嚴(yán)格質(zhì)控：批次間穩(wěn)定性CV-5%
圖2. 文庫擴(kuò)增曲線與標(biāo)準(zhǔn)曲線
圖3. 不同GC含量文庫模板所擴(kuò)增熔解曲線特征峰單一
綠色38% GC文庫；紫色50% GC文庫；黃色70% GC文庫。
小結(jié)
兩種定量方法之間的檢測結(jié)果相當(dāng)！
Qubit方法：優(yōu)點(diǎn)是快速！單個樣本幾秒鐘內(nèi)即可得到測序結(jié)果，直接輸出濃度，非常直觀；同時(shí)也可兼容大部分的酶標(biāo)儀，進(jìn)行批量樣本定量，是常規(guī)文庫定量、dsDNA定量的首選。缺點(diǎn)是檢測的精確度略低，檢測的是樣本中所有的dsDNA，也包含未連上測序接頭的DNA片段，不能特異性的定量有效文庫（有完整測序接頭的文庫）；
qPCR方法：優(yōu)點(diǎn)是精確度非常高，特異性精準(zhǔn)定量有效文庫濃度，非常適用于測量珍貴樣本以及文庫上機(jī)pooling前的精準(zhǔn)定量，另外在PCR-free的文庫構(gòu)建中，由于沒有PCR富集有效文庫的過程，因此也推薦使用qPCR的方法來定量完整的文庫濃度，穩(wěn)定測序產(chǎn)出。缺點(diǎn)是操作相對繁瑣，檢測時(shí)間較長。
總之兩種檢測方法各有千秋，NGS中根據(jù)需求選擇合適的定量方式，最好的是兩者結(jié)合，獲得更高質(zhì)量更穩(wěn)定的測序結(jié)果。
qPCR文庫定量產(chǎn)品推薦
類型 | 產(chǎn)品名稱 | 貨號 | 規(guī)格 | 用途及應(yīng)用場景 |
qPCR定量 | Hieff NGS? Library Quantification Kit for Illumina?, qPCR Master Mix | 12302ES05 | 500 T | ●文庫定量 ●Illumina平臺文庫上機(jī)pooling前精準(zhǔn)定量 ●珍貴樣本文庫定量 ●PCR-free文庫定量 |
12303ES50 | 50 ml | |||
Hieff NGS? Library Quantification Kit for Illumina?, DNA Standard 1-6 | 12307ES09 | 6×96 μL |
