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            首頁 / NGS測序 / 產(chǎn)品應(yīng)用詳情
             
            干貨|聊一聊DNA損傷修復(fù)那些事
             
            DNA測序的迅速發(fā)展，使其應(yīng)用領(lǐng)域越來越廣泛。在DNA測序中，DNA的質(zhì)量、完整性、總量以及純度等需要滿足各項(xiàng)指標(biāo)，才能順利測序并獲得高質(zhì)量的數(shù)據(jù)。而在實(shí)際測序過程中，存儲方式、提取方法、建庫方法等環(huán)境因素會(huì)對DNA的結(jié)構(gòu)造成損害，從而影響測序結(jié)果。

            下面小翌聊一聊DNA損傷和修復(fù)的那些事，說一說NGS中酶促DNA損傷修復(fù)反應(yīng)原理及應(yīng)用。

            什么是DNA損傷，損傷類型及常見受損原因有哪些？

            DNA損傷（DNA damage）是指DNA分子結(jié)構(gòu)發(fā)生了改變，DNA損傷的原因很多，一般可以分為自發(fā)的內(nèi)源性損傷和環(huán)境作用等引起的外源性損傷。環(huán)境因素包括物理因素（如紫外線和電離輻射等）、化學(xué)因素和生物因素等。不同的因素造成的損傷類型不同。

            高通量測序中，要解決的DNA損傷類型基本是外源性因素引起的。常見的DNA損傷類型包括胞嘧啶脫氨成尿嘧啶、AP位點(diǎn)、3’端封閉、切刻和gap及共價(jià)交聯(lián)等。
            胞嘧啶脫氨成尿嘧啶：胞嘧啶在氧化劑的存在下發(fā)生脫落，形成尿嘧啶。在DNA鏈中，原本互補(bǔ)配對的CG堿基對變成了UG堿基對。

            AP位點(diǎn)：也稱為脫嘌呤或嘧啶位點(diǎn)，是氧化損傷的一種，由于活性氧等和DNA的相互作用，導(dǎo)致DNA鏈上的堿基缺失；

            3’端封閉：一般是3’末端被其他基團(tuán)封閉，造成DNA分子不能正常進(jìn)行下游的擴(kuò)增與連接反應(yīng)；

            切刻：雙鏈分子中由于斷裂一個(gè)磷酸二酯鍵而出現(xiàn)的缺口；

            Gap：雙鏈分子中的一條鏈上發(fā)生的斷裂，缺失了部分堿基，形成Gap；

            DNA共價(jià)交聯(lián)：DNA雙螺旋上的堿基之間或與蛋白質(zhì)分子之間共價(jià)結(jié)合；

            胸腺嘧啶二聚體：由UV和電離輻射等因素造成的一種典型的DNA損傷類型，即相鄰的嘧啶以共價(jià)鍵相互結(jié)合形成了一種結(jié)構(gòu)；

            DNA雙鏈斷裂：多由電離輻射、核酸酶等加強(qiáng)的外力引起的DNA較為嚴(yán)重的損傷，較難修復(fù)；

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            DNA損傷類型示意圖
             
            當(dāng)在體內(nèi)時(shí)，DNA受到損傷，正常的細(xì)胞本身有修復(fù)機(jī)制，每時(shí)每刻都會(huì)對損傷的DNA進(jìn)行修復(fù)。在體外對樣本進(jìn)行處理也會(huì)對DNA造成不同程度的傷害。在高通量測序中DNA常見的受損原因主要有：

            樣本存儲方式

            • 福爾馬林固定：這個(gè)過程會(huì)使DNA分子間發(fā)生交聯(lián)反應(yīng)，使得DNA鏈的脆性增加，從而導(dǎo)致DNA斷裂；
            • 石蠟包埋：這個(gè)過程中的高溫滲入會(huì)進(jìn)一步加速核酸的降解；
            • 低溫凍存：液氮或-80℃凍存，這種方式對DNA的損傷程度相對較小。但時(shí)間過久也會(huì)影響核酸的質(zhì)量和完整性。


            DNA提取方式

            • 提取方法中無論是傳統(tǒng)的提取方法如CTAB法、SDS法還是目前較多的商用提取試劑盒，在對組織樣本和DNA進(jìn)行一系列操作時(shí)，都會(huì)因化學(xué)試劑和物理因素對DNA造成損傷。

            DNA損傷修復(fù)的方式及原理是什么

            DNA修復(fù)主要有以下幾種類型：切除修復(fù)、錯(cuò)配修復(fù)（MMR）和雙鏈斷裂修復(fù)（DSBR），如同源重組修復(fù)（HR）和非同源端連接(NHEJ)修復(fù)。修復(fù)過程一般通過酶促反應(yīng)進(jìn)行，不同的酶可以修復(fù)不同的DNA損傷，常見的DNA修復(fù)酶有連接酶、內(nèi)切酶、外切酶、聚合酶、糖基化酶和甲基化酶等，根據(jù)不同的修復(fù)途徑而定。這里我們詳細(xì)說一下高通量測序中經(jīng)常用到的幾類修復(fù)方式：

            切除修復(fù)

            包括核苷酸切除修復(fù)（NER：Nucleotide excision repair）和堿基切除修復(fù)（BER：Base excision repair），由多種酶進(jìn)行多步酶促反應(yīng)。首先在相應(yīng)酶的作用下識別并切除損傷部位，形成的缺口再由DNA聚合酶根據(jù)堿基配對原則引入完好的堿基，再由DNA連接酶連接切刻部分，最后形成完整的DNA雙鏈。

            • NER：可修復(fù)大部分連續(xù)的DNA損傷；
            • BER：可修復(fù)個(gè)別或小部分堿基的損傷，如AP位點(diǎn)、胞嘧啶脫氨、胸腺嘧啶二聚體及修復(fù)3’端封閉等；
            • 切刻和Gap修復(fù)：直接在相應(yīng)DNA聚合酶和DNA連接酶的作用下補(bǔ)齊堿基完成斷鏈單鏈的修復(fù)。




            損傷修復(fù)試劑效果如何？翌圣新升級試劑，成就高品質(zhì)數(shù)據(jù)！

            醫(yī)療領(lǐng)域中對于如FFPE樣本、長期凍存樣本和微量組織樣本等，從中提取符合建庫測序標(biāo)準(zhǔn)的DNA尤為困難，但樣本往往有非常珍貴，于是DNA損傷修復(fù)試劑就成為了首要的解決方式之一。經(jīng)修復(fù)后的樣本，在保證序列準(zhǔn)確性的前提下，可以提升文庫產(chǎn)量并完成測序。翌圣多年專注DNA損傷樣本的測序，拯救質(zhì)量參差不齊的DNA，助力收貨高質(zhì)量的測序數(shù)據(jù)。

            近期，翌圣生物針對Hieff NGS? FFPE DNA Repair Reagent (Cat#12606ES24/12606ES96) 進(jìn)行了升級，同時(shí)兼容機(jī)械法建庫試劑盒，實(shí)現(xiàn)更快修復(fù)，更便捷操作。

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            參考文獻(xiàn)
             
            [1] Hu J ,  Adar S . The Cartography of UV‐induced DNA Damage Formation and DNA Repair[J]. Photochemistry and Photobiology, 2017.
            [2] Chatterjee N ,  Walker G C . Mechanisms of DNA damage, repair, and mutagenesis[J]. Environmental and Molecular Mutagenesis, 2017, 58(1):235-263.
             
             
             
             
             
             
             
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