Annexin V-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒是用FITC標記的Annexin V作為探針，來檢測細胞早期凋亡的發(fā)生，是細胞凋亡檢測實驗中最常用的一種探針組合。
在細胞凋亡早期階段，細胞膜內(nèi)側的磷脂酰絲氨酸（PS）從胞質轉至胞外，暴露在細胞外環(huán)境中，細胞膜通透性增加，從而被PS特異的Annexin-V探針標記。
Annexin-V為Ca2+依賴性磷脂結合蛋白，對PS有極強的結合力。PI是一種經(jīng)濟、穩(wěn)定的核酸染料，它不能透過正常細胞或早期凋亡細胞的完整的細胞膜，但可以透過凋亡晚期和壞死細胞的細胞膜而使細胞核染紅。
將Annexin V與PI聯(lián)合使用時，PI被排除在活細胞和早期凋亡細胞之外，而晚期凋亡細胞和壞死細胞同時被FITC和PI結合染色呈現(xiàn)雙陽性。
圖1. Annexin V-FITC/PI細胞凋亡檢測原理
流式細胞儀分析：
FITC最大激發(fā)波長為488 nm，最大發(fā)射波長525 nm，FITC的綠色熒光在FL1通道檢測；
PI-DNA復合物的最大激發(fā)波長為535 nm，最大發(fā)射波長為615 nm，PI的紅色熒光在FL2或FL3通道檢測。
圖2. Annexin V-FITC/PI細胞凋亡檢測結果
在凋亡實驗中，經(jīng)常會出現(xiàn)假陽性或與預期結果不符的情況，可能的原因有補償調(diào)節(jié)不當、細胞濃度過高、消化過度、藥物干擾、藥物處理時間過長、樣本自身問題等多個方面，接下來，小翌就帶您一起看看該如何得到一張完美的結果圖。
熒光素被激光激發(fā)后發(fā)出不同波長的熒光，理論上每一種熒光通過選擇恰當?shù)臑V光片可被相應的檢測器檢測到，而不受其他熒光的干擾。但目前這些熒光染料都具有寬發(fā)射譜性質，盡管它們的發(fā)射峰各不相同，但發(fā)射譜范圍有一定的重疊【1】，也就是說，相鄰的檢測器會檢測到彼此的熒光信號，這樣就影響了檢測結果的準確性，因此，多色分析時必須進行光譜重疊的校正。【2】
圖3. FITC和PI的發(fā)射光譜
調(diào)節(jié)方法：設置對照
空白管：誘導凋亡的細胞不加染料，用來調(diào)節(jié)熒光通道的光電倍增管電壓；
單染管：分別需要只加PI和熒光標記的Annexin V兩個單染管，用來調(diào)節(jié)2個熒光通道的補償值；
熒光素之間的補償值應保持恒定；雙熒光染色時，如果一個熒光很強，而另一個很弱，則一定要做補償；補償只應用在同一個激光激發(fā)的不同熒光素之間，避免補償不足和過度補償。【3】
細胞濃度過高，培養(yǎng)基消耗過快，導致細胞饑餓發(fā)生凋亡。因此在做細胞凋亡處理前，應盡量使細胞處在最佳狀態(tài)，再進行細胞凋亡誘導處理，避免細胞本身的衰老引起的凋亡。
圖4. 細胞濃度過高導致細胞自發(fā)凋亡，空白對照（左），實驗組(右)
對貼壁細胞，消化是最關鍵的步驟，消化液需用不含EDTA的胰酶，因為Annexin V和PS的結合需要Ca2+，而EDTA是Ca2+ 螯合劑，使用含有EDTA的胰酶會造成假陰性。細消化時可以將胰酶鋪滿孔板底后，輕搖使胰酶與細胞充分接觸，然后倒掉大部分胰酶，利用剩余少量胰酶再消化一段時間，待細胞間空隙增大，瓶底呈花斑狀即可終止，吹打細胞要輕柔，過度消化和機械損傷都會引起細胞膜的損傷，造成假陽性。
圖5. 細胞消化過度導致早期凋亡細胞占89.15%
下圖中可以看出，未經(jīng)處理的空白對照組（左）早期凋亡占3.38%，晚期凋亡細胞占6.64%，而右圖中Q1和Q2中的細胞占90%，幾乎所有細胞都在PI通道產(chǎn)生熒光，判斷是藥物帶來的熒光干擾。因此，在選擇試劑盒時，應盡量避開藥物和細胞自帶的熒光信號。
圖6. 藥物自身的熒光干擾：空白對照（左）和經(jīng)過藥物處理的細胞（右）
樣品處理完畢后應進快進行流式檢測。樣品處理時間過長，也容易導致細胞進入晚期凋亡和壞死階段，如下圖，空白對照組結果正常，但是藥物處理組出現(xiàn)大量凋亡晚期細胞，考慮是藥物處理時間過長導致。
圖7. 藥物處理時間過長：空白對照（左）和經(jīng)過藥物處理的細胞（右）
神經(jīng)細胞膜容易破壞外翻，導致假陽性，所以Annexin V/PI 雙染法流式檢測細胞凋亡不適用于神經(jīng)細胞。
如果樣品來源于血液，請務必除去血液中的血小板。因為血小板含有PS，能與Annexin V結合，從而干擾實驗結果?？梢允褂煤蠩DTA的緩沖劑并在200 g離心洗去血小板。
【1】Pietkiewicz S , Schmidt J H , Lavrik I N . Quantification of apoptosis and necroptosis at the single cell level by a combination of Imaging Flow Cytometry with classical Annexin V/propidium iodide staining[J]. Journal of Immunological Methods, 2015, 423:99-103.
【2】陳軍浩, 劉勇, 鄒征云,等. 流式細胞術Annexin V/PI檢測細胞凋亡陽性界線值及補償值的確定[J]. 現(xiàn)代檢驗醫(yī)學雜志, 2008(04):24-27.
【3】王輝, 高穎. 應用流式細胞儀的常見問題及解決對策[J]. 現(xiàn)代儀器與醫(yī)療, 2012(01):64-65.
相關產(chǎn)品——翌圣Annexin V/PI 系列試劑盒
HB201203
