支原體（mycoplasma）是一種沒(méi)有細(xì)胞壁的最小原核細(xì)胞。在細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中，支原體污染率達(dá)到60%以上，當(dāng)細(xì)胞（特別是傳代細(xì)胞）被支原體污染后，細(xì)胞內(nèi)的DNA、RNA及蛋白表達(dá)發(fā)生改變，污染嚴(yán)重時(shí)細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢，細(xì)胞形態(tài)發(fā)生改變，并出現(xiàn)細(xì)胞病變。因而細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中，防止支原體污染是一個(gè)世界性的難題。
圖1. 支原體污染細(xì)胞后，細(xì)胞形態(tài)發(fā)生改變（來(lái)源：該圖片來(lái)源于網(wǎng)絡(luò)）
支原體污染細(xì)胞后很難察覺(jué)，同時(shí)若細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程受到了支原體污染，徹底清除支原體也是非常困難的。因此在細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中，定期進(jìn)行支原體檢測(cè)，在源頭上清除支原體污染，并做好支原體預(yù)防工作顯得尤為重要。翌圣生物為了全方位的呵護(hù)您的細(xì)胞免受支原體的污染，除提供支原體檢測(cè)試劑盒以外，還包括支原體清除試劑和對(duì)正常細(xì)胞提供支原體預(yù)防試劑，以防支原體污染。
目前檢測(cè)支原體的方法有很多，主要包括：熒光染色法、酶標(biāo)法、低張?zhí)幚淼匾录t染色法、PCR法等。目前YEASEN提供了兩款檢測(cè)試劑盒，包括一步法支原體檢測(cè)試劑盒和PCR法支原體檢測(cè)試劑盒，兩者均是通過(guò)PCR擴(kuò)增檢測(cè)支原體的存在。兩者實(shí)驗(yàn)原理存在差異，但產(chǎn)品性能各有千秋。
一步法支原體檢測(cè)試劑盒
一步法快速支原體檢測(cè)試劑盒是利用Yeasen獨(dú)特的等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)，同時(shí)加入了UDG酶，在極大程度上抑制假陽(yáng)性反應(yīng)。主要原理是若細(xì)胞培養(yǎng)物被支原體污染，支原體DNA的保守序列會(huì)被大量、快速地?cái)U(kuò)增，使反應(yīng)液由藍(lán)紫色變成天藍(lán)色，結(jié)果肉眼可辨，無(wú)需電泳。
圖2. 一步法支原體檢測(cè)試劑盒靈敏度測(cè)試（注：藍(lán)色為陽(yáng)性，紫色為陰性）
PCR法支原體檢測(cè)試劑盒
PCR法支原體檢測(cè)試劑盒，將一步法的1對(duì)引物提高至3對(duì)引物，所用引物為根據(jù)支原體16S-23S rRNA序列保守區(qū)域設(shè)計(jì)通過(guò)巢式PCR擴(kuò)增，只特異性擴(kuò)增支原體DNA，檢出靈敏度與特異性均較高，可以檢測(cè)低至單個(gè)拷貝的支原體。
圖3. PCR法支原體檢測(cè)試劑盒靈敏度測(cè)試（注：NTC為陰性，其余為陽(yáng)性）
一步法和PCR法性能對(duì)比
一步法和PCR法檢測(cè)試劑盒，各有千秋，客戶可以根據(jù)自己需求，選擇合適的試劑盒即可。
圖4. 一步法和PCR法產(chǎn)品性能對(duì)比
若是檢測(cè)到細(xì)胞受到支原體的污染，需要及時(shí)清理來(lái)挽救來(lái)之不易的細(xì)胞。目前YEASEN提供的MycAway? 支原體去除試劑（1000×），是一種混合抗生素制劑，含有三種對(duì)支原體具有抑菌作用的組分，分別是喹諾酮類、四環(huán)素衍生物類和大環(huán)內(nèi)酯類抗生素?？赏ㄟ^(guò)抑制支原體的DNA和蛋白合成，達(dá)到清除支原體的效果，且對(duì)細(xì)胞毒性低，不影響細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)。
圖5. 清除劑清除效果對(duì)比圖
支原體去除產(chǎn)品特點(diǎn)：
毒性低：對(duì)細(xì)胞毒性小，不影響后續(xù)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，如細(xì)胞活力檢測(cè)和細(xì)胞轉(zhuǎn)染等；
操作簡(jiǎn)單：只需將產(chǎn)品添加至支原體污染的培養(yǎng)基中孵育即可；
起效快、周期短：最快3天即可見(jiàn)效，一個(gè)周期（大約7天）即可清除干凈；
去除范圍廣：幾乎能去除所有類型的支原體。
支原體污染是比較難處理，因此預(yù)防就顯的尤為重要。主要包括以下幾個(gè)方面：細(xì)胞預(yù)防（直接加入細(xì)胞培養(yǎng)基中）、超凈臺(tái)預(yù)防（噴霧）、水浴鍋預(yù)防和細(xì)胞培養(yǎng)箱水盤預(yù)防（直接按比例加入）等。
圖6. 不同支原體預(yù)防試劑對(duì)比
總之，支原體帶來(lái)的負(fù)面影響不容忽視。在細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中，我們要定期檢測(cè)支原體，預(yù)防細(xì)胞被污染，是細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中不可或缺的操作步驟。
1.如何檢測(cè)新鮮的培養(yǎng)基和血清是否有支原體污染？
答：把新鮮的培養(yǎng)基或是血清取一定量放在24孔板，于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4d以上（樣品），吸取一定的液體進(jìn)行檢測(cè)。如果樣品的顏色變成天藍(lán)色或者出現(xiàn)PCR擴(kuò)增條帶，則證明含有支原體污染。。
2.一步法檢測(cè)支原體試劑盒中加入的UDG酶，會(huì)影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果嗎？比如抑制等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)，或者導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)結(jié)果假陽(yáng)性等等。
答：加入的UDG酶在室溫下才起作用，而且UDG酶對(duì)溫度敏感、易于滅活，當(dāng)進(jìn)行63°C等溫?cái)U(kuò)增時(shí)，UDG酶因?yàn)闇囟冗^(guò)高就會(huì)失活，不影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
3.支原體清除劑使用周期？
答：一般是1周，如果碰到比較難除盡的，可以適當(dāng)延長(zhǎng)時(shí)間至2周。或者按照1:500進(jìn)行稀釋，但是對(duì)細(xì)胞的毒性會(huì)有所增加，具體要看細(xì)胞的耐受性。
4.支原體噴霧對(duì)于已經(jīng)污染的組培苗，可以直接噴濕除菌？
答：不可以，只能用于細(xì)胞樣品。
HB200703
