■ 什么是FFPE？
FFPE（Formalin-Fixed and Parrffin Embedded），即福爾馬林固定石蠟包埋樣本。由于這種處理方法能夠較長時間地保存組織或制備檢驗所需的組織標本，所以在臨床病理檢驗、腫瘤基因檢測中應用廣泛。在世界范圍內(nèi)，大約有數(shù)十億份組織樣品保存在醫(yī)院或者組織樣品庫中，其中絕大多數(shù)是使用福爾馬林固定石蠟包埋的方法處理的樣品。
FFPE樣本通常代表了珍貴且來源廣泛的生物醫(yī)學研究材料，為闡明疾病機制、回顧性研究等提供了寶貴的資源，但是由于樣本制備以及儲存等多方面的原因，F(xiàn)FPE樣本中的DNA質(zhì)量往往很差。所以如何通過FFPE樣本中獲得的DNA建立合格的文庫已成為當前測序研究領(lǐng)域亟待解決的問題。
圖1 FFPE樣本
■ 為何FFPE樣本中的核酸質(zhì)量差？
FFPE樣本特殊的制作方法和保存過程都會對核酸分子造成多方面的影響。組織醫(yī)學樣本在離體后即開始發(fā)生降解，福爾馬林的固定使組織中的核酸與核酸或核酸與蛋白之間交聯(lián)，石蠟的滲入過程進一步加速核酸的降解，保存時間及環(huán)境對樣品中的核酸也有極大的影響。所以FFPE樣本中的核酸質(zhì)量往往質(zhì)量很差， 進而影響文庫構(gòu)建的產(chǎn)量以及均一性，導致建庫失敗。
表1 影響FFPE樣本中DNA質(zhì)量的主要因素
因素 | 結(jié)果 |
核酸與蛋白發(fā)生交聯(lián) | 影響核酸提取的質(zhì)量 |
磷酸二脂鍵的水解 | 導致DNA的片段化 |
胞嘧啶脫氨基 | 引入C→T，G→A等突變 |
■ 如何提高FFPE樣本的建庫質(zhì)量？
1. 樣本質(zhì)量控制
對于高質(zhì)量的DNA樣本，通過吸光度檢測樣品純度（Nanodrop）和熒光定量（Qubit）進行質(zhì)量檢測即可，但是這對于FFPE樣本來源的DNA是遠遠不夠的， 需要進一步的質(zhì)控評估。目前主要的方法有以下兩種：
1）通過對廣泛存在于gDNA的Alu序列（Alu 247與Alu 115）的擴增產(chǎn)物或者不同qPCR擴增產(chǎn)物濃度的比值來衡量DNA的完整性；
注：Alu247/Alu115：Alu序列是廣泛分布于人基因組的約300bp短重復序列。通過長 (247 bp; Alu247) 、短(115 bp; Alu115) 擴增子比值可評估gDNA的完整度。
Q Score：即Quality Score，是指不同qPCR擴增產(chǎn)物濃度的比值。常用的Q129/Q41和Q305/Q41比值分別指129bp和41bp產(chǎn)物、305bp和41bp產(chǎn)物濃度比值。
2) DIN：即 DNA Integrity Number，是指DNA經(jīng)安捷倫生物分析系統(tǒng) 2200/4200 TapeStation分析并計算的出的數(shù)值，是對DNA完整性的評分。
表2 FFPE樣本質(zhì)控參數(shù)
原理 | 質(zhì)控參數(shù) | 理想樣本參數(shù)值 | 高質(zhì)量FFPE樣本值 |
使用不同長度的引物來擴增大量存在于人類基因組中的序列， 根據(jù)其產(chǎn)物的比值評估 | Alu 247 / Alu 115 | 1 | 0.4 |
Q129/Q41, Q305/Q41 | 1 | Q129/Q41>0.4 | |
Agilent | DIN | 9.8 | >3.5 |
2. 樣本損傷修復
FFPE樣本由于制作與儲存等多方面的原因?qū)е聵颖举|(zhì)量不佳，如果質(zhì)控之后樣本質(zhì)量很差，可對樣本DNA進行修復。通常修復液由不同的酶類根據(jù)不同比例混合而成，能夠?qū)NA樣本中胞嘧啶脫氨成尿嘧啶、切刻或者缺口等問題能夠進行修復，進而從整體上提升建庫成功率。
表3 FFPE 修復試劑作用
損傷類型 | 是否修復 |
胞嘧啶脫氨成尿嘧啶 | √ |
切刻與缺口 | √ |
堿基氧化 | √ |
3’端封閉 | √ |
DNA片段化 | × |
核酸蛋白交聯(lián) | × |
通常情況下，F(xiàn)FPE修復試劑可以通過對樣本的修復顯著提高低質(zhì)量FFPE樣本的建庫產(chǎn)出，而對高質(zhì)量FFPE樣本的建庫產(chǎn)量提升并不明顯（如下圖所示）。
圖2 FFPE修復試劑盒對建庫產(chǎn)量的影響（Input DNA: 10 ng; Cycles：10）
數(shù)據(jù)來源于翌圣UltimaTM DNA建庫試劑盒（Cat12199）測試結(jié)果，F(xiàn)FPE修復試劑為翌圣FFPE DNA Repair Reagent(Cat#12606)
3. 樣本高效建庫
高效的建庫試劑盒能夠最大程度的利用有限的樣本，使其轉(zhuǎn)化為合格的文庫。FFPE樣本由于樣本濃度更低，質(zhì)量較差，往往對試劑盒的要求也更高，搭配更高效的建庫試劑盒也成為了FFPE樣本建庫的必備之選。
建庫試劑盒的效率評估指標主要3個方面：
NGS建庫文庫轉(zhuǎn)化率：指文庫中兩端都連上接頭的目的片段占總片段數(shù)的比值。文庫轉(zhuǎn)化率影響文庫的多樣性與文庫的質(zhì)量，高的文庫轉(zhuǎn)化率一定程度上意味著文庫豐度與測序的覆蓋度更好，尤其是在FFPE樣本中可能出現(xiàn)一些其他類型損傷的情況下，轉(zhuǎn)化率過低勢必會影響最終文庫的產(chǎn)出與文庫的豐度。
圖3 雙端連接的文庫通過橋式擴增成簇
文庫擴增均一性：指的是讀取數(shù)據(jù)在基因組或目標區(qū)域的分布均一程度。其生信分析圖如圖4所示，一般認為覆蓋越均勻，達到特定深度所需的測序數(shù)據(jù)就越少，覆蓋均一性的偏向通常是在DNA片段化和文庫擴增步驟中引入的。
圖4 不同GC含量樣本測序數(shù)據(jù)均一性
文庫擴增效率與保真性：文庫擴增效率即獲得特定文庫產(chǎn)量所需的循環(huán)數(shù)，循環(huán)數(shù)越低意味著擴增效率越高；保真性即PCR擴增中出現(xiàn)堿基錯配的數(shù)量，相同循環(huán)數(shù)條件下，錯配數(shù)量少則保真性越高。
■ 十年匠心品質(zhì)，只為一顆初心——UltimaTM，就是你要的終極檔案
Hieff NGS? Ultima DNA Library Prep Kit（Cat#12199）是翌圣生物針對Illumina測序平臺研發(fā)的高效DNA建庫試劑盒，本品采用高質(zhì)量酶學組成，具有優(yōu)異的文庫轉(zhuǎn)化率與擴增效率，徹底解決FFPE/cfDNA建庫難的問題。多樣本驗證，同等條件下文庫產(chǎn)量是K*品牌的1-3倍。適用于常規(guī)動植物基因組、微生物基因組、FFPE、cfDNA、ChIP DNA等所有樣本建庫，助力獲得優(yōu)異的測序數(shù)據(jù)。
精簡流程：末端修復與A尾巴添加一步完成，無需純化，大大縮減建庫時間；
極高效的DNA連接酶：自主創(chuàng)新研發(fā)高效DNA連接酶Fast T4 DNA Ligase，多樣本驗證連接效率是N*品牌的2-3倍；
強擴增效率的高保真酶：自主創(chuàng)新研發(fā)強擴增效率高保真酶Canace?Ⅱ，極大降低文庫擴增帶來的偏好性。性能媲美K*品牌H*Fi酶；
圖5 UltimaTM建庫試劑盒多樣本驗證均可獲得優(yōu)異的文庫質(zhì)量
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