基于免疫學(xué)基本原理（抗原與抗體特異性結(jié)合），衍生出一系列針對(duì)蛋白研究的相關(guān)實(shí)驗(yàn)，但影響免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)（如Elisa、WB等）顯色成功的因素有很多，除了抗原抗體反應(yīng)外最關(guān)鍵的是實(shí)驗(yàn)最后一步——加入底物，酶與底物反應(yīng)后通過(guò)肉眼觀察或酶標(biāo)儀讀取 OD 值來(lái)分析樣本。根據(jù)不同的酶：辣根過(guò)氧化物酶（HRP）和堿性磷酸酶（AP），所作用的底物有所不同。小翌已為您準(zhǔn)備好了幾款常用的顯色底物，下面一一為您介紹下：
TMB，即3, 3′,5 ,5′-Tetramethylbenzidine，中文全稱3,3',5,5'-四甲基聯(lián)苯胺，是辣根過(guò)氧化物酶（HRP）的常用顯色底物之一。在HRP的催化下，TMB被過(guò)氧化氫（H2O2）氧化生成藍(lán)色產(chǎn)物。主要吸收峰在370 nm和652 nm。在加入硫酸或者磷酸終止上述反應(yīng)后，產(chǎn)物轉(zhuǎn)變?yōu)辄S色，最大吸收峰為450 nm。
圖1 .TMB顯色原理
傳統(tǒng)的TMB顯色試劑通常以AB液形式提供（TMB和H2O2溶液分到兩管，僅在使用前才可混合使用），并且容易產(chǎn)生沉淀，使用起來(lái)相對(duì)不方便，且容易導(dǎo)致操作誤差。為克服以上缺點(diǎn)，我司采用新的TMB顯色技術(shù)，將所有相關(guān)試劑全部混合配成單一溶液。具有以下優(yōu)點(diǎn)：
即開即用：使用前無(wú)需做AB液混合的準(zhǔn)備；檢測(cè)靈敏度不低于AB液體系；
單 組 分：僅由單一溶液組成，簡(jiǎn)化了操作步驟，也降低了操作誤差，結(jié)果更加穩(wěn)定；
穩(wěn)定性高：含有獨(dú)特的穩(wěn)定劑，保證溶液4℃下長(zhǎng)期保存；
靈敏度高：相比于其他HRP酶顯色底物（如ABTS和OPD）相比，檢測(cè)靈敏度更高。
安全無(wú)毒：本TMB溶液不含有DMF或DMSO等有機(jī)溶劑，安全無(wú)毒。
另外，TMB溶液可分為沉淀可溶型和沉淀不可溶型，前者適用于ELISA及其他通過(guò)液體反應(yīng)檢測(cè)HRP的應(yīng)用，后者適用于WB或其他通過(guò)沉淀反應(yīng)檢測(cè)HRP的應(yīng)用。
AP底物-pNPP顯色液
pNPP，即4-Nitrophenyl phosphate disodium salt，中文全稱4-硝基苯磷酸二鈉，是堿性磷酸酶（AP）的底物，在酶（如堿性磷酸酶，AP）和輔助物質(zhì)（如緩沖液和金屬離子）存在的條件下，pNPP可以被酶催化水解為對(duì)硝基苯酚（pNP），pNP是一種黃色產(chǎn)物，其吸收峰位于405 nm左右。pNPP常用于基于AP標(biāo)記的ELISA。本產(chǎn)品具有本底低、穩(wěn)定性高、批間差小的特點(diǎn)，提供了優(yōu)越的信號(hào)反應(yīng)體系，適用于顯色時(shí)間≤20分鐘的檢測(cè)實(shí)驗(yàn)。
圖2.pNPP顯色原理
AP底物-BCIP/NBT顯色液
5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸鹽（BCIP）/硝基四氮唑藍(lán)（NBT）是堿性磷酸酶(AP)的最佳底物組合之一。堿性磷酸酶是一種常用于酶標(biāo)記實(shí)驗(yàn)的酶，它可以催化底物BCIP的水解和NBT的還原。在BCIP的水解過(guò)程中，產(chǎn)生的5-溴-4-氯-3-吲哚在堿性條件下氧化為有色產(chǎn)物。同時(shí)，NBT在還原條件下被還原為紫色產(chǎn)物。這些有色產(chǎn)物可以在細(xì)胞或膜上形成可見的紫色或紫褐色沉淀，用于定性或定量檢測(cè)酶的存在或活性。
傳統(tǒng)的BCIP/NBT顯色試劑通常需要在使用前混合（NBT和BCIP溶液分到兩管，同時(shí)反應(yīng)需要添加堿性磷酸酯酶顯色緩沖液），使用起來(lái)相對(duì)不方便，且容易導(dǎo)致操作誤差。為克服以上缺點(diǎn)，我司采用新的BCIP/NBT顯色技術(shù)，將所有相關(guān)試劑全部混合配成單一溶液。具有以下優(yōu)點(diǎn)：
即開即用：使用前無(wú)需做AB液混合的準(zhǔn)備；檢測(cè)靈敏度不低于AB液體系；
單 組 分：僅由單一溶液組成，簡(jiǎn)化了操作步驟，也降低了操作誤差，結(jié)果更加穩(wěn)定；
穩(wěn)定性高：含有獨(dú)特的穩(wěn)定劑，保證溶液4℃下長(zhǎng)期保存。
選擇指南
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貨號(hào) |
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名稱 |
單組分TMB 顯色液 (ELISA,HRP顯色用) |
單組份TMB 顯色液 （WB, HRP顯色用） |
單組份TMB顯色液（芯片，HRP顯色用） |
pNPP顯色液 （ELISA, AP顯色用） |
單組份BCIP/NBT顯色液 （WB, AP顯色用） |
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適用 |
ELISA |
Western blot以及 Northern blot、 Southern blot等 |
蛋白芯片、 微陣列芯片等 |
ELISA |
Western blot、Northern blot、 Microarray、ELISpot 等 |
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底物 |
HRP |
HRP |
HRP |
AP |
AP |
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檢測(cè)限 |
6 pg/well |
100 ng |
20 pg |
10 pg/well |
30 pg |
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抗體稀釋比 |
一抗：1:1000； 二抗：1:5000-1:50000 |
一抗：1:500; 二抗：1:2000-1:20000 |
一抗：1:1000; 二抗：1:5000-1:10000 |
一抗：1:500； 二抗：1:5000-1:20000 |
一抗：1:500； 二抗：1:5000-1:50000 |
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生成物類型 |
沉淀可溶型 |
沉淀不可溶型 |
沉淀不可溶型 |
沉淀可溶型 |
沉淀不可溶型 |
價(jià)格優(yōu)勢(shì)
【注】已全部換算為100 mL體系產(chǎn)品價(jià)格
圖3.Yeasen產(chǎn)品與其他品牌同級(jí)別產(chǎn)品價(jià)格比對(duì)
常見問(wèn)題
Q1：背景顯色太深
1）如果背景（沒(méi)有樣品的對(duì)照）顯色太深，一方面需考慮使用適當(dāng)?shù)姆忾]液進(jìn)行封閉，如商業(yè)化的封閉液或者商業(yè)化的和一抗相同來(lái)源的血清（5-10%）進(jìn)行封閉。另一方面，直接使用經(jīng)過(guò)適當(dāng)親和吸附的二抗，以減小二抗的非特異性交叉吸附。
2）可以考慮縮短顯色時(shí)間，或降低二抗?jié)舛取Ａ硗?，選擇適當(dāng)強(qiáng)度的洗滌液，或延長(zhǎng)洗滌時(shí)間也會(huì)有所幫助。
3）可考慮TMB底物本身反應(yīng)過(guò)于強(qiáng)烈。為了避免沉淀的產(chǎn)生，可在終止反應(yīng)后馬上讀數(shù)，或者進(jìn)一步稀釋一抗和/或HRP結(jié)合物。
Q2：沒(méi)有顯色或顯色太弱
1）適當(dāng)提高一抗或二抗的濃度。檢測(cè)二抗效果，滴一滴稀釋二抗在離心管內(nèi)，檢測(cè)二抗是否被正常顯色。
2）可以考慮使用更加靈敏的放大檢測(cè)體系，例如使用生物素檢測(cè)體系。
3）可以適當(dāng)延長(zhǎng)顯色時(shí)間。
4）如果上述改進(jìn)不能獲得預(yù)期效果，可以考慮更換效果更好的一抗或ELISA試劑盒。
訂購(gòu)信息
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產(chǎn)品名稱 |
貨號(hào) |
規(guī)格 |
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100mL |
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100mL |
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100mL |
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100mL |
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100mL |
相關(guān)產(chǎn)品
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產(chǎn)品名稱 |
貨號(hào) |
規(guī)格 |
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83650ES03 |
5塊/盒 |
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83650ES20 |
5塊/盒,20盒/箱 |
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