產(chǎn)品描述

翌圣慢病毒包裝試劑盒（Lentiviral Packaging Kit）由優(yōu)化的慢病毒包裝輔助質(zhì)?；旌衔铮?/span>Lentiviral Mix）、表達(dá)eGFP蛋白的對(duì)照質(zhì)粒和高效轉(zhuǎn)染試劑（HG Transgene^TM Reagent）組成，可以兼容第二代和第三代的慢病毒包裝質(zhì)粒，且具有慢病毒包裝時(shí)間周期短（一周之內(nèi)即可拿到純化好的高滴度慢病毒）、病毒滴度高的優(yōu)勢(shì)，可應(yīng)用于針對(duì)不同基因和藥物靶標(biāo)的臨床前細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)和整體動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。非常適合于病毒包裝初試者。

 

產(chǎn)品組分

 

類別	組分編號(hào)	組分名稱	儲(chǔ)存	產(chǎn)品編號(hào)/規(guī)格
				41102ES10（10T）	41102ES20（20T）	41102ES40（40T）
Part Ⅰ	41102-A	Lentiviral Mix(1 μg/μL)	-20℃	100 μL	200 μL	400 μL
	41102-C	eGFP 對(duì)照質(zhì)粒（Amp+）	-20℃	1.5 μg	1.5 μg	1.5 μg
Part Ⅱ	41102-B	HG TransgeneTM Reagent	+4℃	0.6 mL	1.2 mL	2×1.2 mL

 

運(yùn)輸與保存方法

冰袋運(yùn)輸。HG Transgene^TM Reagent（41102-B）于4 ℃保存，其余組分(41102-A、41102-C)均于-20℃保存。保質(zhì)期一年有效。

 

慢病毒包裝所需其他材料（選用）

1）DMEM：Hyclone

2）FBS,GOLD：MP

3）Penicillin-Stretomycin：YEASEN

4）HEK 293T/293FT：慢病毒包裝及低度檢測(cè)所用工具細(xì)胞（HEK293T cat.NO.CEH001）

5）Antibiotics：用于穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株篩選，如Puromycin，G418等

6）Competent cells：GMco（Cat：CCE01）

 

病毒包裝前的準(zhǔn)備

慢病毒表達(dá)載體：包含病毒包裝，侵染和將病毒重組基因整合到基因組DNA中以便表達(dá)目的基因或者shRNA的基本元件。

DNA溶液的制備：以QIAGEN公司的質(zhì)粒抽提試劑盒提取慢病毒包裝系統(tǒng)中各種質(zhì)粒DNA，質(zhì)粒DNA溶于無(wú)菌的TE或ddH₂O中，以紫外光吸收法測(cè)定其濃度及純度，保證所提質(zhì)粒DNA 的A260/A280在1.8～2.0之間。

細(xì)胞狀態(tài)：良好的細(xì)胞狀態(tài)對(duì)病毒的包裝至關(guān)重要，避免細(xì)胞培養(yǎng)基有細(xì)菌、真菌或支原體的污染，盡量使用傳代次數(shù)較少的細(xì)胞，如果細(xì)胞是剛復(fù)蘇的話，最好傳兩代之后再包裝。

慢病毒包裝

翌圣生物慢病毒載體表達(dá)系統(tǒng)由pGMLV慢病毒載體和Lentiviral Mix質(zhì)粒組成。pGMLV慢載體中含有HIV的基本元件5’LTR和3’LTR以及其他輔助元件，例如WPRE和cPPT/CTS等。翌圣可以根據(jù)不同的實(shí)驗(yàn)?zāi)康尼槍?duì)pGMLV載體改造以進(jìn)行啟動(dòng)

 

子活性研究、基因表達(dá)研究、RNA干擾等研究。Lentiviral Mix能夠表達(dá)病毒包裝需要的各種必需成分如：gag基因，編碼病毒主要的結(jié)構(gòu)蛋白；pol基因，編碼病毒特異性的酶；rev基因，編碼調(diào)節(jié)gag和pol基因表達(dá)的調(diào)節(jié)因子；還含有單純皰疹病毒來(lái)源的VSV-G基因，提供病毒包裝所需要的包膜蛋白，可以兼容第二代和第三代的慢病毒包裝質(zhì)粒。

 

使用流程

制備編碼慢病毒顆粒的重組病毒質(zhì)粒及其輔助包裝原件載體質(zhì)粒，重組質(zhì)粒載體和輔助質(zhì)粒載體分別進(jìn)行高純度無(wú)內(nèi)毒素抽提，使用HG Transgene^TM Reagent進(jìn)行共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后18 h 更換為完全培養(yǎng)基，培養(yǎng)48 h后，收集富含慢病毒顆粒的細(xì)胞上清液，對(duì)其濃縮后得到高滴度的慢病毒濃縮液，在293T細(xì)胞中測(cè)定病毒滴度。在一定滴度范圍內(nèi)的慢病毒顆?？梢詽M足大部分體內(nèi)體外實(shí)驗(yàn)需求。

1）293T細(xì)胞分盤：轉(zhuǎn)染前一天，將已經(jīng)長(zhǎng)好的細(xì)胞以合適比例傳代到10 cm培養(yǎng)皿中，當(dāng)細(xì)胞長(zhǎng)到~80%時(shí)準(zhǔn)備轉(zhuǎn)染。

2）轉(zhuǎn)染前換液：轉(zhuǎn)染前1~2 h 將需要轉(zhuǎn)染的細(xì)胞換新鮮的培養(yǎng)基，12 mL/10 cm皿。注意：293T細(xì)胞貼壁性不是很好，換液時(shí)應(yīng)小心滴加盡量避免沖起細(xì)胞。

3）轉(zhuǎn)染：取無(wú)菌的1.5 mL EP管或15 mL離心管，按下列組分配制反應(yīng)體系：

 

無(wú)血清DMEM	1 mL
DNA	10 μg
Lentiviral Mix	10 μL(10 μg)
HG TransgeneTM Reagent	60 μL

 

混勻后，室溫放置18 min~20 min后，均勻滴加到提前換過(guò)液的培養(yǎng)皿中，后置于CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

4）換液：轉(zhuǎn)染18~20 h后，小心吸掉細(xì)胞培養(yǎng)液棄于盛有消毒液的廢液杯中（注意：此時(shí)培養(yǎng)基中已含有少量的病毒，必須經(jīng)處理后才能丟棄，所用的移液槍頭等必須經(jīng)消毒液浸泡處理后才能丟棄），然后加15 mL新鮮的培養(yǎng)基（也可根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求換為無(wú)血清的DMEM）繼續(xù)培養(yǎng)。

5）病毒收集：換液48 h后，吸取細(xì)胞上清液于50 mL離心管，4℃，500 g離心5 min，上清液用0.45 μm濾器過(guò)濾后轉(zhuǎn)移到新的離心管中。此時(shí)上清液中的病毒顆?？梢灾苯尤z測(cè)滴度或者感染目的細(xì)胞，如果對(duì)病毒的滴度及純度有較高要求，可對(duì)上清液進(jìn)行濃縮與純化。

6）病毒分裝與保存：將病毒以40~50 μL分裝，后保存于-80℃。

 

注意事項(xiàng)

1）為了您的健康，實(shí)驗(yàn)操作時(shí)請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服和帶一次性手套。

2）本產(chǎn)品僅作科研用途！

HB220803