產(chǎn)品描述

PreScission Protease是一種由人鼻病毒14型的3C蛋白酶（human rhinovirus (HRV) type 14 3C protease）和GST組成的融合蛋白。該蛋白酶可在低溫下（4°C）特異識(shí)別短肽Leu-Glu-Val-Leu-Phe-Gln-Gly-Pro，并在Gln和Gly氨基酸殘基之間進(jìn)行酶切。底物的識(shí)別和切割不僅依賴于融合蛋白的一級(jí)結(jié)構(gòu)還依賴于融合蛋白的二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)。它可以特異性的將pGEX-6P系列等載體表達(dá)出的帶有酶底物識(shí)別多肽序列融合蛋白的GST標(biāo)簽進(jìn)行分離。本品由大腸桿菌中重組表達(dá)，以無菌液體形式提供。

 

產(chǎn)品性質(zhì)

中文別名（Chinese Synonym）	重組Prescission蛋白酶
英文別名（English Synonym）	3C protease，Picornain 3C，PSP
來源（Source）	大腸桿菌表達(dá)
分子量（Molecular Weight）	約46kDa
物理外觀（Physical Appearance）	無菌無色液體
儲(chǔ)存緩沖液（Storage Buffer）	25mM Tris-HCl（pH8.0），150mM NaCl，1mM EDTA，5mM DTT，50%（V/V）Glycerin
10×酶切緩沖液（10×Cleavage Buffer）	500mM Tris-HCl（pH7.0），1.5M NaCl，10mM EDTA，10mM DTT
純度（Purity）	經(jīng)SDS-PAGE及HPLC分析，純度> 95%
酶活定義（Unit Definition）	在5℃條件下反應(yīng)16小時(shí)，能夠切割10µg的GST標(biāo)簽的融合蛋白達(dá)90%以上所需的酶量定義為一個(gè)活性單位

 

運(yùn)輸和保存方法

干冰運(yùn)輸。-80℃長期儲(chǔ)存，有效期2年；小量分裝-20℃保存，有效期6個(gè)月；

 

注意事項(xiàng)

1）100mM ZnCl₂、4mM AEBSF和100μM Chymostatin將抑制PreScission Protease 50%以上酶活性；

2）配制好的10×Cleavage Buffer置于-20°C保存。避免反復(fù)凍融！

3）為了您的安全和健康，請穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。

4）本產(chǎn)品僅作科研用途！

 

使用方法

工作液濃度應(yīng)根據(jù)具體實(shí)驗(yàn)確定，建議進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)摸索最佳實(shí)驗(yàn)濃度。

1）初始條件摸索a. 按照下表設(shè)置酶切反應(yīng)體系：

反應(yīng)物組成	體積
GST融合蛋白	100μg
Prescission Protease	2μL（1U/μL）
10×Cleavage Buffer	10μL
ddH2O	至100μL

b. 將反應(yīng)混合物置于4℃反應(yīng)15-16h；

c. 取20μL樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析，根據(jù)結(jié)果，優(yōu)化反應(yīng)所需的最適酶量，重復(fù)步驟；

d. 在實(shí)際操作中，建議酶用量1:25-1:100U/μg融合蛋白。

2）柱上酶切GST標(biāo)簽蛋白（以10mg GST標(biāo)簽蛋白/mL凝膠為例）

a. 4℃條件下，使用10倍柱體積酶切緩沖液洗滌已結(jié)合GST標(biāo)簽蛋白的純化柱，并去除殘留緩沖液；

b. 準(zhǔn)備PreScission Protease：約每100μg GST標(biāo)簽蛋白使用2U PreScission Protease (或按照經(jīng)步驟1優(yōu)化后的條件)。對于10mg GST標(biāo)簽蛋白需使用200U PreScission Protease，用PreScission酶切緩沖液稀釋至與凝膠柱相同的體積，即1mL。

c. 將稀釋好的1mL PreScission Protease泵入純化柱中，4°C保持4-8h（為確保酶切完全，可以4°C酶切過夜）。如果蛋白結(jié)合是在離心管中進(jìn)行的，可將準(zhǔn)備好的PreScission Protease直接加入離心管中，4°C在搖床上緩慢搖動(dòng)4-8小時(shí)（為確保酶切完全，可以4°C酶切過夜）。

d. 用1倍柱床體積的PreScission Protease酶切緩沖液洗滌，重復(fù)三次，分別收集每次的洗滌液。如果酶切反應(yīng)是在離心管中進(jìn)行的，1000g離心2分鐘，收集上清，然后加入1mL酶切緩沖液重懸沉淀，離心(1000g×2min)收集上清，接著再加入1mL酶切緩沖液重懸沉淀，離心(1000g×2min)收集上清。洗脫組分中含有切除了GST標(biāo)簽的目的蛋白，而GST標(biāo)簽和帶有GST標(biāo)簽的PreScission Protease則仍然結(jié)合在凝膠柱上。

3）柱下酶切GST標(biāo)簽蛋白（以10mg GST標(biāo)簽蛋白/mL凝膠為例）

a. 使用脫鹽柱快速除去洗脫組分中的GSH、咪唑等特殊組分，或用PreScission Protease酶切緩沖液進(jìn)行透析。

b. 按每100μg標(biāo)簽蛋白加入2U PreScission Protease的比例加入蛋白酶，4°C孵育4-8h或者過夜。

c. 將酶切后的蛋白樣品加入預(yù)先用PreScission Protease酶切緩沖液平衡好的GSTSep Glutathione Agarose Resin（Cat#20507ES），室溫結(jié)合20-30分鐘。

d. 500g離心5分鐘，收集上清，其中含有切除了標(biāo)簽的目的蛋白，PreScission Protease則結(jié)合在凝膠沉淀中。如果目的蛋白是GST標(biāo)簽蛋白，那么殘留的沒有被酶切的GST標(biāo)簽蛋白、PreScission Protease和酶切下來的GST標(biāo)簽則結(jié)合在凝膠沉淀中，切除了標(biāo)簽的目的蛋白在溶液中。

 

HB210917