地瓜视频APP免费观看下载安装_www免费视频com_AA区一区二区三无码精片_人人澡人人看_japanese熟睡侵犯

        1. <li id="43v4v"></li>

            <li id="43v4v"></li>

            Hieff? Fast Cell Direct RT set (for probe)

            更多活動更多優(yōu)惠,盡在翌圣商城》

            批量采購, 請點擊詢價

            產(chǎn)品說明書

            FAQ

            COA

            已發(fā)表文獻(xiàn)

             

            Hieff® Fast Cell Direct Probe RT-qPCR Kit 適用于對各種動物細(xì)胞進(jìn)行基因定量表達(dá)分析(如cell line 化的貼壁細(xì)胞和懸浮細(xì)胞、原代培養(yǎng)細(xì)胞、各種干細(xì)胞、iPS 細(xì)胞等),無需提RNA,可直接進(jìn)行qPCR表達(dá)分析,用時短,操作簡單,出錯率低,最短只需1.5 h就可高效完成從模板制備到反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)及基因表達(dá)分析等步驟。該產(chǎn)品為探針法細(xì)胞直擴RT-qPCR試劑盒的反轉(zhuǎn)錄模塊,為補充試劑。

             

            組分信息

            組分編號

            組分名稱

            16815ES40

            16815ES60

            16815-A

            4× Hifair® FCD RT Mix

            200 μL

            500 μL

            16815-B

            RNase Free H2O

            2 mL

            5 mL

             

            儲存條件

            長期保存時請于-25~-15℃保存,有效期1年。

             

            使用說明

            一、裂解產(chǎn)物的制備

            1. 將試劑放置室溫下融化,使用前上下顛倒,輕輕混勻,并輕微離心后使用,避免起泡。沒有混勻試劑、使用振蕩器混勻、未在冰上配置試劑等會導(dǎo)致反應(yīng)性能下降。
            2. 將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至離心管中*,5000 rpm離心2 min收集細(xì)胞**,充分吸除培養(yǎng)基。若細(xì)胞在96孔板中培養(yǎng),可直接吸除培養(yǎng)基。
            3. 各個孔內(nèi)加入FCD Washing Buffer 150 μL,吸打清洗細(xì)胞,5000 rpm離心2 min,吸盡FCD Washing Buffer。
            4. 各孔中加入48 μL FCD Lysis Buffer溶液,2 μL DNase I溶液,室溫吸打混勻后靜置5 min,孵育后加入2.5 μL FCD Stop Solution***, 吸打混勻5次左右,即可得到裂解產(chǎn)物****,細(xì)胞數(shù)量超過1× 105 cells時可能會有裂解殘留物屬正?,F(xiàn)象。

            *50 μL裂解體系適配細(xì)胞數(shù)的基本要求是每孔1× 102 - 1× 105 cells,若細(xì)胞數(shù)量較多,可適當(dāng)?shù)缺壤黾覨CD Lysis Buffer溶液和DNase Ⅰ溶液的用量。

            **不同細(xì)胞的離心條件不同,請使用適合于所用細(xì)胞的離心速度進(jìn)行離心。

            ***50 μL的裂解液需加入2.5 μL的FCD Stop Solution。依實驗需要,加入裂解液量增大時需相應(yīng)增大FCD Stop Solution的量。

            ****細(xì)胞裂解產(chǎn)物溶液長期保存時,請置于-25~-15

            二、反轉(zhuǎn)錄

            1. 室溫融化4× Hifair® FCD RT Mix后輕微顛倒混勻,置于冰上并按下表配置反應(yīng)體系:

            組分

            體積 μL

            終濃度

            4× Hifair® FCD RT Mix

            5

            裂解產(chǎn)物*

            x

            -

            RNase-free H2O

            Up to 20

            -

            1 反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系

            *避免吸入細(xì)胞碎片,推薦使用量為2 μl,最大不超過反應(yīng)體系的55%。

            1. 移液器輕輕混勻上述配制的反應(yīng)液,按下表程序進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)**:

            反應(yīng)溫度

            反應(yīng)時間

            37℃

            5 min

            85℃

            5 sec

            2 反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)程序

            **反轉(zhuǎn)錄溫度推薦使用37℃,反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物可直接進(jìn)行下游qRT-PCR檢測。為避免反轉(zhuǎn)錄體系對qPCR反應(yīng)的抑制,得到合適的Ct值(10-35),可將產(chǎn)物稀釋10-1000倍后使用。若短時間內(nèi)不進(jìn)行下游實驗,可放置于-25~-15保存。

            三、熒光定量PCR

            1. 體系配置

            使用下列組份比例配制反應(yīng)液(配制過程請于冰上進(jìn)行):

            組分

            體積(μL)

            終濃度

            2× Hieff® FCD Probe qPCR Mix

            12.5

            Forward Primer (10 μM)

            0.5

            200 nM

            Reverse Primer (10 μM)

            0.5

            200 nM

            Probe (10 μM)

            0.25-1

            100-400 nM

            反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物*

            x

            -

            RNase-free H2O

            Up to 25

            -

            3 qPCR反應(yīng)體系

            *高濃度模板易導(dǎo)致非特異擴增,可適當(dāng)將模板稀釋5-50倍。模板推薦用量4 μL。反應(yīng)性能較差時,可以在0.2-1.0 μM范圍內(nèi)調(diào)整引物探針濃度。

            1. 熒光定量PCR快速擴增程序(推薦)

            本產(chǎn)品推薦使用快速程序擴增,可大大減少反應(yīng)時間。使用Tm值較低的引物難以擴增時,可額外調(diào)整退火溫度。

            循環(huán)步驟

            溫度

            時間

            循環(huán)數(shù)

            預(yù)變性

            95℃

            10 sec

            1

            變性

            95℃

            5 sec

            45

            退火/延伸**

            60℃

            10 sec

            4 qPCR反應(yīng)程序(快速)

            **退火/延伸溫度、終延伸時間可根據(jù)實驗要求適當(dāng)調(diào)整。 快速程序適用于絕大多數(shù)基因,個別復(fù)雜二級結(jié)構(gòu)基因可嘗試常規(guī)程序。

            1. 熒光定量PCR常規(guī)擴增程序

            實驗儀器不滿足快速反應(yīng)時間時,也可使用常規(guī)程序進(jìn)行擴增。

            循環(huán)步驟

            溫度

            時間

            循環(huán)數(shù)

            預(yù)變性

            95℃

            10 sec

            1

            變性

            95℃

            15 sec

            40-45

            退火/延伸**

            60℃

            30 sec

            5 qPCR反應(yīng)程序(常規(guī))

             

            注意事項

            1. 使用前,將凍存的各組分充分融解并輕輕混勻后使用。
            2. 實驗時,請盡量使用無污染的耗材,避免污染。
            3. 本產(chǎn)品避免反復(fù)凍融,配制時應(yīng)避免強光照射。
            4. 為了您的安全和健康,請穿實驗服并戴一次性手套操作。
            5. 本產(chǎn)品僅作科研用途!

             

            Ver.CN20231207

            400-6111-883