產(chǎn)品說明書
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COA
已發(fā)表文獻(xiàn)
產(chǎn)品簡介
Tn5轉(zhuǎn)座酶特異性識別轉(zhuǎn)座子兩端反向重復(fù)的ME序列(Mosaic End)，形成轉(zhuǎn)座復(fù)合體后隨機(jī)的將轉(zhuǎn)座子插入靶DNA中。Protein G 偶聯(lián)轉(zhuǎn)座酶(Protein G-Tn5)，即通過將Protein G與改造的超高活性Tn5轉(zhuǎn)座酶融合，形成兼具雙重活性的新型融合酶(pG-Tn5 Transposase)，可在抗體引導(dǎo)下精準(zhǔn)靶向切割目的蛋白附近的DNA序列，適用于CUT&Tag (Cleavage Under Targets and Tagmentation)技術(shù)。CUT&Tag是替換傳統(tǒng)的ChIP-Seq用以研究蛋白質(zhì)-基因組互作的新技術(shù)，與后者相比，它具有顯著優(yōu)勢，如：信噪比高，可重復(fù)性好，實(shí)驗(yàn)周期短（1天實(shí)現(xiàn)從細(xì)胞到文庫構(gòu)建），細(xì)胞投入量低等，該方法適用于表觀遺傳學(xué)、腫瘤、干細(xì)胞等研究領(lǐng)域。
組分信息
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組分編號 |
組分名稱 |
14530ES60 |
14530ES76 |
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14530-A |
pG-Tn5 Transposase (10 U/μL) |
10 μL |
50 μL |
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14530-B |
Assemble Buffer |
100 μL |
500 μL |
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14530-C |
5×Tagment buffer |
500 μL |
3×1 mL |
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14530-D |
6×Terminate Solution |
500 μL |
3×1 mL |
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14530-E |
Annealing Buffer |
500 μL |
3×1 mL |
儲存條件
pG-Tn5 Transposase于-85~-65℃保存，其余組分可于-25~-15℃保存，有效期1年。
注意事項(xiàng)
1. 轉(zhuǎn)座酶對溫度敏感，建議盡快完成接頭包埋，生成的轉(zhuǎn)座子可于-25~-15℃保存，有效期1年。
2. 本產(chǎn)品僅作科研用途。
3. 為了您的安全和健康，請穿實(shí)驗(yàn)服并佩戴一次性手套操作。
使用說明
以高通量測序建庫為例，在使用前，請務(wù)必仔細(xì)閱讀使用說明。
- 接頭制備
1）Illumina平臺參考引物名稱及序列：
Primer A：5'-phos-CTGTCTCTTATACACATCT-NH2-3'
Primer B：5′-TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAG-3′
Primer C：5′-GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAG-3′
2）使用Annealing Buffer溶解Primer A、Primer B、Primer C至100 μM。
3） 分別配制如下反應(yīng)體系：
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組分 |
反應(yīng)1 |
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Primer A（100 μM） |
10 μL |
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Primer B（100 μM） |
10 μL |
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total |
20 μL |
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組分 |
反應(yīng)2 |
|
Primer A（100 μM） |
10 μL |
|
Primer C（100 μM） |
10 μL |
|
total |
20 μL |
4）分別將反應(yīng)1和反應(yīng)2渦旋振蕩充分混勻，并短暫離心使溶液回到管底。置于PCR儀內(nèi)，進(jìn)行如下反應(yīng)程序：熱蓋105℃ On，94℃加熱2 min。時(shí)間到后，停止反應(yīng)程序，不要打開熱蓋，讓PCR管在PCR儀器中自然冷卻2 h，然后再于4℃中放置5 min。
5）反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)1和反應(yīng)2等體積混合，混勻。命名為Adapter Mix，-25~-15℃保存。
2．轉(zhuǎn)座子生成
1） 配置以下反應(yīng)體系：
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組分 |
體積（μL） |
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pG-Tn5 Transposase (10 U/μL) |
2 |
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Adapter mix (25 μM)* |
1.6 |
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Assemble Buffer |
Up to 20 |
2）反應(yīng)條件：使用移液器輕輕吹打充分混勻。置于25℃反應(yīng)1 h（熱蓋關(guān)閉）。反應(yīng)產(chǎn)物命名為pG-Tn5 Mix，可直接應(yīng)用于建庫實(shí)驗(yàn)，或-25~-15℃保存。
3. DNA片段化測試
1）配置以下反應(yīng)體系：
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組分 |
體積（μL） |
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Input DNA (50 ng/μL) |
X* |
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5×Tagment buffer |
4 |
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pG-Tn5 Mix |
1** |
|
ddH2O |
Up to 20 |
*DNA 使用量越大，片段化產(chǎn)物平均長度越長；反之，片段化產(chǎn)物平均長度越短。
**如需提高打斷程度，可提高pA-Tn5 Mix使用量；反之，可減少酶使用量。
2）片段化反應(yīng)程序
輕輕吹打或振蕩混勻，短暫離心。按照下表所示反應(yīng)程序，進(jìn)行片段化反應(yīng)。
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溫度 |
時(shí)間 |
|
熱蓋105℃ |
On |
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55°C |
10 min |
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4°C |
Hold |
3）DNA片段化終止
配置以下反應(yīng)體系，在上述片段化產(chǎn)物中添加下表中各反應(yīng)組分，使用移液器輕輕吹打20次混勻。
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組分 |
體積（μL） |
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片段化產(chǎn)物 |
20 |
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6×Terminate Solution |
4 |
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Total |
24 |
按照下表所示反應(yīng)程序，進(jìn)行終止反應(yīng)。
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溫度 |
時(shí)間 |
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熱蓋105℃ |
On |
|
55°C |
10 min |
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4°C |
Hold |
待樣品溫度降到4°C后，取出PCR管，進(jìn)行片段化產(chǎn)物純化，可以選擇1.2×磁珠純化，推薦使用Hieff NGS® DNA Selection Beads（Cat#12601ES），最終使用21 μL ddH2O洗脫片段化產(chǎn)物。請勿使用TE等含金屬離子絡(luò)合劑的緩沖液洗脫片段化產(chǎn)物！
4）片段化產(chǎn)物質(zhì)量控制
a. 使用 Qubit 進(jìn)行濃度測定。
b. 使用 Agilent Technologies 2100 Bioanalyzer 進(jìn)行長度分布檢測。
5）片段化產(chǎn)物擴(kuò)增
可根據(jù)具體的實(shí)驗(yàn)?zāi)康呐c測序平臺選擇合適的試劑進(jìn)行擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)。
Ver.CN20241230
