本產(chǎn)品適用于多重PCR實(shí)驗(yàn)。2×Hieff^® Multiplex PCR Master Mixfor Pathogen以熱啟動(dòng)多重Taq酶制劑與2×擴(kuò)增緩沖液為組分配置成預(yù)混液。本預(yù)混液可快速便捷地用于多重PCR反應(yīng)，擴(kuò)增子GC含量25-75%范圍內(nèi)可以有效擴(kuò)增。具備高均一性、高特異性和高靈敏度的特點(diǎn)。本試劑適用于30~300對(duì)以內(nèi)不同大小片段的多重?cái)U(kuò)增，也可用于進(jìn)行數(shù)千重及以上擴(kuò)增子的捕獲。

 

運(yùn)輸與保存方式

冰袋運(yùn)輸。-25 ~ -15℃儲(chǔ)存，有效期2年。

 

實(shí)驗(yàn)流程

1. 推薦反應(yīng)體系：

一輪反應(yīng)程序

組分	體積（μL）	終濃度
2×Hieff® Multiplex PCR Master Mix for Pathogen	15	1×
Primer mix	x	0.02 μM-0.5 μM
模板DNA	x	1 ng-400 ng
無(wú)菌超純水	x	-
總體積	To 30

【注】

1）上表中DNA量和引物濃度均為推薦用量和濃度，可根據(jù)具體實(shí)驗(yàn)情況進(jìn)行調(diào)整最適濃度。

2）參考建議：每條引物的濃度可在0.02 μM-0.5 μM范圍內(nèi)進(jìn)行調(diào)整。

3）預(yù)混液中已經(jīng)包含擴(kuò)增所需要的酶、dNTP、鹽離子等，無(wú)需額外添加。

二輪反應(yīng)程序

組分	體積（μL）	終濃度
2×Hieff® Multiplex PCR Master Mix for Pathogen	15	1×
Primer Index mix	4（6pmol）
一輪純化產(chǎn)物	11
無(wú)菌超純水	x	-
總體積	To 30

2. 推薦反應(yīng)程序：

循環(huán)步驟	溫度（℃）	時(shí)間	循環(huán)數(shù)
預(yù)變性	95℃	3 min	1
變性	95℃	30 sec	X
退火	60℃	30 sec
延伸	72℃	30 sec
終延伸	72℃	3 min
暫存	4℃	-	1

【注】

1）退火時(shí)間可以根據(jù)Panel種類不同，進(jìn)行適當(dāng)延長(zhǎng)，或者是梯度退火，比如64℃ 1 min，60℃ 1 min;

2）延伸時(shí)間以最長(zhǎng)片段為準(zhǔn)。延伸時(shí)間太長(zhǎng)會(huì)導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增增多，可通過(guò)縮短延伸時(shí)間來(lái)提高擴(kuò)增特異性，延伸時(shí)間不少于30 sec。 

3）針對(duì)模板含量較低的樣本，可通過(guò)增加循環(huán)數(shù)提高擴(kuò)增產(chǎn)出。

3. 循環(huán)數(shù)推薦：

單管引物重?cái)?shù)	推薦循環(huán)數(shù) （10 ng gDNA ）		退火延伸時(shí)間
	一輪	二輪
10-50	10~28	18~28	30 s~2 min
50-200	10~28	16~28	30 s~2 min
200-800	10~28	14~28	30 s~2 min
800以上	10~28	12~28	30 s~4 min

【注】

上表是基于10 ng gDNA進(jìn)行的一輪及二輪循環(huán)數(shù)的推薦；當(dāng)投入量大于10 ng，二輪的相應(yīng)的循環(huán)數(shù)可以減少；當(dāng)投入量小于10 ng，一，二輪的相應(yīng)的循環(huán)數(shù)要相應(yīng)的增加。

4. 多重?cái)U(kuò)增引物純化

一輪 PCR 產(chǎn)物 0.9×磁珠純化

1) 準(zhǔn)備工作：將 Hieff NGS^® DNA Selection Beads 磁珠由冰箱中取出，室溫平衡至少 30 min。 配制 80%乙醇。

2) 渦旋振蕩或充分顛倒磁珠以保證充分混勻。

3) 吸取 27 μL Hieff NGS^® DNA Selection Beads（0.9×，Beads:DNA=0.9:1）至一輪 PCR 產(chǎn)物中，室溫孵育 5 min。

4) 將 PCR 管短暫離心并置于磁力架中分離磁珠和液體，待溶液澄清后（約 5 min），小心移除上清。

5) 保持 PCR 管始終置于磁力架中，加入 200 μL 新鮮配制的 80%乙醇漂洗磁珠，室溫孵育 30 sec 后，小心移除上清。

6) 重復(fù)步驟 5，總計(jì)漂洗兩次。

7) 保持 PCR 管始終置于磁力架中，開(kāi)蓋空氣干燥磁珠至剛剛出現(xiàn)龜裂（不超過(guò) 5min）。

8) 直接加入 11 μL ddH₂O，將 PCR 管從磁力架中取出，渦旋振蕩或使用移液器輕輕吹打至充分混勻，室溫靜置 5 min。進(jìn)入下一步反應(yīng)。

二輪 PCR 產(chǎn)物 0.9×磁珠純化

1) 準(zhǔn)備工作：將 Hieff NGS^® DNA Selection Beads 磁珠由冰箱中取出，室溫平衡至少 30 min。 配制 80%乙醇。

2) 渦旋振蕩或充分顛倒磁珠以保證充分混勻。

3) 吸取 27 μL Hieff NGS^® DNA Selection Beads（0.9×，Beads:DNA=0.9:1）至一輪 PCR 產(chǎn)物中，室溫孵育 5 min。

4) 將 PCR 管短暫離心并置于磁力架中分離磁珠和液體，待溶液澄清后（約 5 min），小心移除上清。

5) 保持 PCR 管始終置于磁力架中，加入 200 μL 新鮮配制的 80%乙醇漂洗磁珠，室溫孵育 30 sec 后，小心移除上清。

6) 重復(fù)步驟 5，總計(jì)漂洗兩次。

7) 磁珠晾干后，將PCR管從磁力架上取下，加入30 µL Nuclease-free ddH₂O覆蓋磁珠，使用移液器吹打混勻。室溫孵育2 min。如果磁珠干燥開(kāi)裂，適當(dāng)延長(zhǎng)孵育時(shí)間。

8）將PCR管短暫離心收集后置于磁力架中，分離磁珠和液體直到溶液澄清(約5 min)。 小心吸取25 µl上清轉(zhuǎn)移至新的EP管中，繼續(xù)進(jìn)行下一步反應(yīng)。

 

HB230308