產(chǎn)品簡介

 

CAR/TCR基因拷貝數(shù)檢測試劑盒適用于定量檢測來源于HIV-1型慢病毒載體技術制備的人源細胞產(chǎn)品，如CAR-T或TCR-T細胞基因組中CAR或TCR基因的拷貝數(shù)。

CAR/TCR基因拷貝數(shù)檢測試劑盒基于熒光探針定量PCR原理，采用多重qPCR方法分別檢測轉(zhuǎn)移質(zhì)粒上與整合或表達功能相關的DNA序列和人體細胞中單拷貝基因(Single Copy Gene, SCG)的方法，計算得到樣本中平均每個細胞的目的基因拷貝數(shù)，如CAR或TCR基因拷貝數(shù)水平。其定量限可以達到10¹ copies/μL水平。該試劑盒需要與本公司的磁珠法殘留DNA樣本前處理試劑盒(Cat#18461ES/18462ES)配套使用。

 

產(chǎn)品信息

 

貨號	41313ES50 / 41313ES60
規(guī)格	50 T / 100 T

 

組分信息

 

組分編號	組分名稱	41313ES50	41313ES60
41313-A	CAR/TCR qPCR Mix	0.75 mL	1.5 mL
41313-B	CAR/TCR Primer&probe Mix	200 μL	400 μL
41313-C	DNA Dilution Buffer	2×1.8 mL	4×1.8mL
41313-D	CAR/TCR DNA Control (2.1×108 copies/μL)	25 μL	50 μL
41313-E	IC*	50 μL	100 μL

^*IC：Internal control，內(nèi)部對照。

 

運輸和儲存條件

 

1. 所有組分均干冰運輸，-25~-15℃保存，有效期2年。且41313-A和41313-B均需避光保存。

2. 收到貨后，請檢查共5個組分是否齊全，并立即放入對應的保存溫度中儲存。

 

適用機型

 

包含但不限于以下儀器：

Thermo Scientific：ABI 7500，ABI Quant Studio 5；

上海宏石醫(yī)療科技：SLAN-96S。

 

使用說明

 

1. CAR/TCR DNA定量參考品的稀釋和標準曲線的制備

CAR/TCR DNA定量參考品是同時含有CAR/TCR目的基因序列和SCG目的基因序列的質(zhì)粒DNA，所以試劑盒的CAR/TCR DNA Control組分里，CAR/TCR和SCG的基因拷貝數(shù)是一樣的。

用試劑盒中的DNA Dilution Buffer（DNA稀釋液）將CAR/TCR DNA Control定量參考品進行梯度稀釋^*，稀釋濃度依次為2.1×10⁶ copies/μL、2.1×10⁵ copies/μL、2.1×10⁴ copies/μL、2.1×10³ copies/μL、2.1×10² copies/μL。操作如下：

1）將試劑盒中CAR/TCR DNA Control和DNA Dilution Buffer置于室溫融化，然后輕微振蕩混勻，低速離心10 sec。

2）取6支干凈的1.5 mL離心管，分別標記為Std0、Std1、Std2、Std3、Std4、Std5。

3）在標記Std0的1.5 mL管中加90 μL DNA Dilution Buffer和10 μL CAR/TCR DNA Control，即稀釋為2.1×10⁷ copies/μL，振蕩混勻后短暫快速離心10 sec，該濃度可分裝置于-25~-15℃短期保存（不超過6個月）^**，使用時避免反復凍融。

4）在Std1、Std2、Std3、Std4、Std5管中先分別加入90 μL DNA Dilution Buffer^***，再進行梯度稀釋^****，稀釋方法如下：

稀釋管	稀釋比例	終濃度
		CAR/TCR (copies/μL)	SCG (copies/μL)
Std1	10 μL Std0 + 90 μL DNA Dilution Buffer	2.1×106	2.1×106
Std2	10 μL Std1 + 90 μL DNA Dilution Buffer	2.1×105	2.1×105
Std3	10 μL Std2 + 90 μL DNA Dilution Buffer	2.1×104	2.1×104
Std4	10 μL Std3 + 90 μL DNA Dilution Buffer	2.1×103	2.1×103
Std5	10 μL Std4 + 90 μL DNA Dilution Buffer	2.1×102	2.1×102

表1 標準品梯度稀釋

*每個濃度做3個復孔，該試劑可測試2.1×10⁶ copies/μL~2.1×10² copies/μL線性范圍。若需要，可適當擴大或縮小線性范圍。

**為減少反復凍融次數(shù)和避免污染，建議初次使用時將DNA定量參考品分裝儲存于-25~-15℃。

***已融化未使用的DNA Dilution Buffer可保存于2~8℃ 7天，若長時間不用，請放置于-25~-15℃。

****為確保模板完全混勻，每個梯度稀釋時需輕微震蕩混勻約1 min。

2. 樣本加標回收質(zhì)控ERC的制備

根據(jù)需要設置ERC中CAR/TCR DNA標準品濃度（以制備加2.1×10⁴ copies CAR/TCR DNA量的ERC為例），具體操作：

1） 取100 μL待測樣本加入1.5 mL潔凈的離心管中，再加入10 μL Std4，混勻，標記為ERC。

2） 加標回收ERC和同批待測樣本一起進行樣本前處理，制備加標回收ERC純化液。

3. 陰性抽提質(zhì)控NCS的制備

根據(jù)實驗設置陰性抽提質(zhì)控NCS，具體操作如下：

1） 取100 μL樣本基質(zhì)溶液（或DNA Dilution Buffer）加入1.5 mL潔凈的離心管中，標記為NCS。

2） 陰性質(zhì)控NCS和同批待測樣本一起進行樣本前處理，制備成陰性質(zhì)控NCS純化液。

4. 無模板對照NTC的制備

根據(jù)實驗設置無模板對照NTC，具體操作如下：

1） 無模板對照NTC無需進行樣本前處理，在qPCR法檢測CAR/TCR DNA含量階段開始配置即可。

2） 每管或孔中的NTC反應體系為20 μL Mix混合液（即15 μL CAR/TCR qPCR Mix + 4μL CAR/TCR Primer&Probe Mix+ 1μL IC）+ 10 μL DNA Dilution Buffer，建議配置3個重復孔的量。

5. 反應體系

反應體系	體系（μL）
CAR/TCR qPCR Mix*	15
CAR/TCR Primer&probe Mix	4
IC	1
DNA template**	10
總體積***	30

表2 標準品反應體系

^*根據(jù)反應孔數(shù)計算本次所需的Mix混合液總量：Mix混合液=（反應孔數(shù)+2）×(15+4+1) μL（含有2孔的損失量）。通常，每個樣本做3個重復孔。

^**反應孔數(shù)=（5個濃度梯度的標準曲線+1個無模板對照NTC+1個陰性抽提質(zhì)控NCS+待測樣TS個數(shù)+待測樣本對應加標回收ERC個數(shù)）×3。

NTC (No Template Control)：DNA Dilution Buffer

NCS (Negative Control Solution)：樣本基質(zhì)溶液或DNA Dilution Buffer進行樣本前處理后，所得純化液為NCS

TS (Test Sample)：待測樣本

ERC (Extraction Recovery Control)：待測樣本中加入如2.1×10⁴ copies標準品DNA后進行樣本前處理，所得純化液為加標回收ERC

^***加樣完成密封好管子后，請低速離心10 sec將管壁的液體離心收集至管底，再震蕩混勻5 sec以上，完全混勻反應液，再低速離心10 sec將管壁的液體離心收集至管底，如有氣泡，需將氣泡排盡。

下圖為參考板位：

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

A

NTC

待測樣本TS1

待測樣本TS1

待測樣本TS1

標準曲線Std1

標準曲線Std1

標準曲線Std1

B

NTC

待測樣本TS2

待測樣本TS2

待測樣本TS2

標準曲線Std2

標準曲線Std2

標準曲線Std2

C

NTC

待測樣本TS3

待測樣本TS3

待測樣本TS3

標準曲線Std3

標準曲線Std3

標準曲線Std3

D

標準曲線Std4

標準曲線Std4

標準曲線Std4

E

NCS

樣本加標ERC1

樣本加標ERC1

樣本加標ERC1

標準曲線Std5

標準曲線Std5

標準曲線Std5

F

NCS

樣本加標ERC2

樣本加標ERC2

樣本加標ERC2

G

NCS

樣本加標ERC3

樣本加標ERC3

樣本加標ERC3

H

表3 上機參考板位

該示例是對CAR/TCR基因拷貝數(shù)的qPCR法檢測操作的展示，檢測樣本包括：5個濃度梯度的CAR/TCR DNA標準曲線、1個無模板對照NTC、1個陰性質(zhì)控NCS、3個待測樣本TS、3個樣本加標回收ERC。建議每個樣本做3個重復孔。

6. 擴增程序參數(shù)設置（兩步法）（以ABI公司7500 qPCR儀、軟件版本2.0為例）

1）創(chuàng)建空白新程序，選擇絕對定量檢測模板。

2）創(chuàng)建2個檢測探針，第一個命名為“CAR/TCR-DNA”，選擇報告熒光基團為“FAM”，猝滅熒光基團為“None”；第二個命名為“SCG，選擇報告熒光基團為“VIC”，猝滅熒光基團為“None”；再創(chuàng)建1個檢測探針，命名為“IC”，選擇報告熒光基團為“CY5”，猝滅熒光基團為“None”。參比熒光為ROX”（參比熒光可根據(jù)儀器型號等情況，選擇是否需要添加；若選擇ROX校準，建議閾值線選擇0.06）。

3）在“Assign target (s) to the selected wells”面板中，將標準曲線孔的“Task”一欄設置為“Standard”，并且在“Quantity”一欄分別賦值為“2100000”、“210000”、“21000”、“2100”、“210”（含義為每孔的DNA濃度，單位為copies/μL），并且在相應的“sample name”一欄中命名為“2100000 copies/μL”、“210000 copies/μL”、“21000 copies/μL”、“2100 copies/μL”、“210 copies/μL”；將無模板對照NTC孔的“Task”一欄設置為“NTC”；將陰性質(zhì)控NCS孔、待測樣本TS孔、樣本加標回收ERC孔“Task”一欄設置為“Unknown”，并且在相應的“Sample Name”一欄中分別命名為“NCS”、“TS”、“ERC”，之后點擊“Start Run”，開始儀器運行。

4）擴增程序設置：設置反應體積30 μL。

循環(huán)步驟	溫度（℃）	時間	循環(huán)數(shù)
污染消化	37℃	5 min	1
預變性	95℃	5 min	1
變性	95℃	15 sec	45
退火/延伸（收集熒光）	60℃	30 sec

表4 擴增程序

 

7. qPCR 結(jié)果分析

1）在“Analysis”的“Amplification Plot”面板中，系統(tǒng)會自動給出“Threshold”，有時系統(tǒng)給出的“Threshold”離基線太近，導致復孔之間Ct相差甚遠，可手動調(diào)節(jié)“Threshold”至合適位置，點擊“Analyze”。此時可在“Multicomponent Plot”初步查看擴增曲線的形態(tài)是否正常。

2）在“Analysis”的“Standard Curve”面板中，可讀取標準曲線的R²、擴增效率(Eff%)、斜率(Slope)、截距(Intercept)等。正常的標曲：R²>0.99，擴增效率在90%≤Eff%≤110%范圍內(nèi)，Slope在-3.6~-3.1。

3）在“Analysis”的“View well table”面板中，“Quantity”一欄可讀取無模板對照NTC、陰性質(zhì)控NCS、待測樣本TS、樣本加標回收ERC的檢測值，單位為copies/μL，后續(xù)可在檢測報告中進行單位換算。

4）結(jié)果分析的參數(shù)設置需依據(jù)具體的機型及使用的軟件版本，一般也可由儀器自動判讀。

5）根據(jù)待測樣本TS和樣本加標回收ERC的檢測結(jié)果計算加標回收率，加標回收率要求在50%~150%之間。加標回收率計算公式：回收率(%) = {樣本加標測定值(eg.copies/µL)-樣本測定值(eg.copies/µL)} x洗脫體積(µL) / DNA加入量理論值(eg.copies) x 100%。

6）陰性質(zhì)控NCS的Ct值應為Undetermined或Ct值≥35。

7）無模板對照NTC的檢測結(jié)果應為Undetermined或Ct值≥38。

8）每個細胞中的CAR或TCR拷貝數(shù)=

 

注意事項

 

1. 使用本試劑前請仔細閱讀本說明書，實驗應規(guī)范操作，包括樣本處理、反應體系的配制及加樣。

2. 每個組分在使用前都應充分震蕩混勻，低速離心。

3. 為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。

4. 本產(chǎn)品僅作科研用途。

 

Ver.CN20231227