NHS-Activated MagBeads 是一種預活化的聚合物磁性微球，表面為NHS 基團修飾，能夠與含氨基的蛋白或多肽的偶聯(lián)，其主要用于親和純化或者分析檢測抗體、抗原和其他生物分子。為任何所需蛋白質(zhì)偶聯(lián)到磁珠表面提供了一種便利的方式。與傳統(tǒng)的羧基、氨基磁珠相比，表面含NHS基團的磁珠無需事先采EDC/NHS或戊二醛進行活化，只需簡單地將含氨基的生物配體溶解于偶聯(lián)緩沖液中，將蛋白溶液與磁珠孵育2-4h便可將生物配體，通過 NHS-酯化學共價偶聯(lián)到磁珠上。這一過程不需要危險化學品或冗長的反應方案，具有操作簡單、偶聯(lián)條件溫和、生物配體偶聯(lián)快速高效的優(yōu)點。

活化的磁珠含有能與伯胺反應以形成穩(wěn)定的酰胺鍵的 N-羥基-琥珀酰亞胺 (NHS) 功能基團。一旦它們共價連接，固定的蛋白不會從磁珠表面浸出。在實驗中使用制備的磁珠時，非特異性結(jié)合可忽略不計，因為在偶聯(lián)程序中，非反應 NHS-酯基團被徹底封閉。NHS 活化磁珠可通過手動磁力架進行偶聯(lián)和處理。偶聯(lián)后，制備的磁珠通常用于親和純化程序。

該磁珠適用于含氨基的蛋白、抗體、酶、多肽、核酸等生物分子的共價偶聯(lián)。偶聯(lián)后，制備的磁珠可應用于免疫檢測、免疫沉淀、免疫共沉淀、蛋白/抗體分離純化等實驗。該產(chǎn)品生物配基偶聯(lián)效率高，可高效簡單偶聯(lián)且共價偶聯(lián)穩(wěn)定，可避免抗體與目標蛋白的共洗脫，其實際使用效果可替代DynaBeads Antibody Coupling kit。

 

產(chǎn)品性質(zhì)

基質(zhì)	聚合物磁性微球
偶聯(lián)量	>10 μg IgG/mg 介質(zhì)
磁珠濃度	10 mg/mL
微球粒徑	1 μm
儲存緩沖液	100%異丙醇

 

運輸和保存方法

冰袋運輸。-20℃儲存，有效期2年。

 

注意事項

1.為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。

2.本產(chǎn)品僅作科研用途！

 

使用方法

一、緩沖液配制

所用水和緩沖液在使用之前建議用0.22 μm或0.45 μm濾膜過濾。

清洗液：1 mM HCI

偶聯(lián)液：0.2 M NaHCO₃, 0.5 M NaCI, pH8.0

封閉液：0.5 M 乙醇胺，0.5 M NaCI, pH8.3 或 0.1 M Tris, pH8.5

清洗液1：0.1 M乙酸-乙酸鈉，0.5 M NaCI, pH3.0

清洗液 2：0.1 M Tris-HCI, 0.5 M NaCI, pH8.0

保護液: PBS , 0.01% Tween-20,0.02% NaN₃

【注】偶聯(lián)液可以選擇碳酸鹽、磷酸鹽等不含氨基的緩沖液體系。緩沖液體系中加入一定濃度的鹽離子減少非特異性吸附。

 

二、樣本制備

樣品用偶聯(lián)液溶解，濃度約5-10 mg/ml。

 

三、抗原偶聯(lián)

1 .取適量磁珠，吸去保護液，用1 mM HCI清洗液清洗一次，再用偶聯(lián)液清洗一次。磁珠加入清洗液，混勻后立刻放在磁力架上吸附，吸棄上清?？梢赃x用預冷的溶液快速清洗，減少預活化介質(zhì)的水解。

2. 溶解好的樣品加入至清洗好的磁珠中，磁珠：樣品溶液體積比約1:1-2。

3. 28°C振蕩反應2-4 h或4°C過夜。確保磁珠懸浮起來，否則會大大影響偶聯(lián)效率。

4. 反應完后收集偶聯(lián)樣品，以便檢測偶聯(lián)效率。去離子水清洗磁珠，加入2倍磁珠體積的封閉液，28°C振蕩反應1 h。

【注】偶聯(lián)后無法用紫外吸收測定上清蛋白濃度，建議用電泳或者BCA定量法檢測偶聯(lián)效率。

5. 將上述反應體系取出，流干其中的封閉液，用3倍磁珠體積的去離子水清洗磁珠，清洗液1、去離子水、清洗液2和去離子水重復沖洗2 次，然后以10 mg/ml的濃度保存在保護液中，于2-8°C保存。

 

四、純化流程

以磁珠偶聯(lián)抗體，純化抗原為例的純化步驟。

4.1緩沖液的準備

【注】所用水和緩沖液在使用之前建議用0.22 μm或0.45 μm濾膜過濾。

平衡/洗雜液：0.15 M NaCI, 20 mM Na₂HPO₄, pH 7.0

洗脫液：0.1 M甘氨酸，pH 3.0

中和液：1 M Tris-HCI, pH 8.5

4.2磁珠預處理  將偶聯(lián)好的磁珠混合均勻，取計算量（根據(jù)上樣量和磁珠載量計算）的磁珠懸浮液（后文均以100 μL為例），轉(zhuǎn)移至離心管中，放置在磁分離器上，靜置大約1 min，待溶液變澄清后，用移液器吸棄上清液。再將離心管從磁分離器上取下來，加入與所取磁珠懸浮液等體積（100 μL）的平衡液，使用槍頭反復吹打5次，將離心管置于磁分離器上，大約1min，待溶液變澄清后，用移液器吸棄上清液，重復洗滌2次。

4.3樣品吸附  在預處理的磁珠中加入樣品溶液，漩渦振蕩均勻，在室溫下置于翻轉(zhuǎn)混合儀或者手工輕輕翻轉(zhuǎn)離心管，使樣品和磁珠充分接觸并吸附，混合30 min以上，置于磁分離器上，大約1min，待溶液變澄清后，吸棄上清液。

4.4洗雜  向離心管中加入初始磁珠懸浮液5倍體積（500 μL）的洗雜液，振蕩懸浮，混合1-2 min，然后置于磁分離器上，大約1 min，待溶液變澄清后，吸棄上清液。該操作重復兩次。

4.5洗脫  在上述離心管中加入3-5倍懸浮液體積（300-500 μL）的洗脫液，用移液器吹打5次，然后在室溫下置于翻轉(zhuǎn)混合儀或者手工輕輕翻轉(zhuǎn)離心管，5-10 min后，置于磁分離器上，大約1 min，待溶液變澄清后，吸取上清液，收集洗脫組分，即為目標蛋白。

4.6洗脫組分中和  向洗脫組分中加入洗脫體積十分之一的中和液，調(diào)節(jié)pH值至7.0-8.0。

4.7磁珠保存  使用后的磁珠用1 mL洗脫液重懸磁珠，然后置于磁分離器上，大約1 min，待溶液變澄清后，吸棄上清液。該操作重復兩次。再加入1 mL 平衡液，懸浮磁珠，然后置于磁分離器上，大約1min,待溶液變澄清后，吸棄上清液。加入保護液至磁珠濃度為10 mg/mL, 置于2-8℃保存。

 

HB220324