Hifair®  III Reverse Transcriptase是在Hifair^® Ⅱ Reverse Transcriptase基礎(chǔ)上通過基因工程技術(shù)得到的新一代逆轉(zhuǎn)錄酶，與Hifair® Ⅱ Reverse Transcriptase相比，其cDNA合成速度快，且熱穩(wěn)定性大幅度提高，可耐受高達(dá)60℃的反應(yīng)溫度，適合具有復(fù)雜二級(jí)結(jié)構(gòu)的RNA模板的逆轉(zhuǎn)錄。同時(shí)，該酶增強(qiáng)了與模板的親和力，非常適合少量模板以及低拷貝基因的逆轉(zhuǎn)錄。Hifair^®  III Reverse Transcriptase合成全長cDNA的能力也有了提升，可擴(kuò)增長達(dá)19.8 kb的cDNA。

產(chǎn)品組分

編號(hào)	組分	產(chǎn)品編號(hào)/規(guī)格
		11302ES12 (10000 U)	11302ES75 (5*10000 U)
11302	Hifair®  III Reverse Transcriptase, 200 U/μl, Glycerol-free	50 μL	250 μL

產(chǎn)品應(yīng)用

全長cDNA文庫構(gòu)建；終點(diǎn)法PCR；實(shí)時(shí)定量PCR等。

活性定義

以Poly(A) .Oligo(dT)為模板-引物，在37℃，10 min內(nèi)，將1 nmol的dTTP摻入為酸不溶性物質(zhì)所需要的酶量定義為1個(gè)活性單位（U）。

運(yùn)輸與保存方法

冰袋運(yùn)輸。4℃保存，有效期6個(gè)月。

注意事項(xiàng)

1. 請(qǐng)保持實(shí)驗(yàn)區(qū)域潔凈；操作時(shí)需穿戴干凈的手套、口罩；實(shí)驗(yàn)所用耗材均需保證RNase free，以防止RNase污染；

2. 所有操作均應(yīng)在冰上進(jìn)行，防止RNA降解；

3. 為保證高效率逆轉(zhuǎn)錄，建議使用高質(zhì)量的RNA樣本；

4. 為了您的安全和健康，請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并佩戴一次性手套操作。

 

第一鏈cDNA合成操作步驟

1. RNA變性（此步為可選步驟，RNA變性有助于打開二級(jí)結(jié)構(gòu)，可在很大程度上提高第一鏈cDNA的產(chǎn)量。）

組分	使用量
RNase free ddH2O	to 13 μL
Oligo (dT)18 (50 μM) or Random Primers (50 ng/μL)   or Gene Specific Primers (2 μM)	1 μL
	or 1 μL
	or 1 μL
模板RNA	Total RNA: 10 pg -5 μg或mRNA:10 pg-500 ng

65℃加熱5 min，迅速置于冰上冷卻2 min。簡短離心收集反應(yīng)液后加入下表中的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液，并用移液器輕輕吹打混勻。

2. 逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系配制（20 μL體系）

組分	使用量
上一步的反應(yīng)液	13 μL
5×Buffer	4 μL
dNTP Mix (10 mM)	1 μL
Hifair® III Reverse Transcriptase, 200 U/μl, Glycerol-free	1 μL
RNase inhibitor (40 U/µL)	1 μL

3. 逆轉(zhuǎn)錄程序設(shè)置

溫度	時(shí)間
25℃	5 min
55℃	15-30 min
85℃	5 min

【注】

1）當(dāng)使用Random Primers時(shí)，需25℃，孵育5 min；若使用Oligo (dT)₁₈或Gene Specific Primers，此步可省略；

2）逆轉(zhuǎn)錄溫度：推薦使用55℃；對(duì)于高GC含量模板或者復(fù)雜模板，可將逆轉(zhuǎn)錄溫度提高到60℃；

3) 可將逆轉(zhuǎn)錄時(shí)間延長到45-60min，有助于提高產(chǎn)量；

4）85℃加熱5 min，目的是使逆轉(zhuǎn)錄酶失活。

※ 逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物可立即用于后續(xù)PCR或qPCR反應(yīng)，也可-20℃短期保存，若需長期保存，建議分裝后，于-80℃保存，避免反復(fù)凍融。

 

相關(guān)產(chǎn)品

產(chǎn)品名稱	貨號(hào)	規(guī)格
dNTP Mix (10 mM each)	10124ES76	500 μL
	10124ES80	1 mL
Bst II DNA polymerase	12908ES60	1600 U
	12908ES97	8000 U
	12908ES98	40000 U
Murine RNase inhibitor (40 U/μL) 鼠源RNase抑制劑	10603ES05	2 KU
	10603ES10	10 KU
	10603ES20	100 KU
	10603ES60	200 KU

 

HB210923