產(chǎn)品說明書
FAQ
COA
已發(fā)表文獻
Hifair® Ⅲ One Step RT-qPCR Probe Kit是以RNA為模板進行定量PCR反應(yīng)的試劑盒。在實驗的過程中，逆轉(zhuǎn)錄和定量PCR在同一反應(yīng)管中進行，簡化了實驗操作，降低了污染的風(fēng)險。本試劑盒以RNA為模板，使用基因特異性引物，利用耐熱Hifair® Ⅲ Reverse Transcriptase高效合成第一鏈cDNA，并搭配使用探針和UNICON® HotStart Taq DNA Polymerase，配合優(yōu)化的緩沖體系能夠特異靈敏的對RNA模板進行精確定量。
本試劑盒以預(yù)混的Mix形式提供，2×Hifair® Ⅲ P buffer包含優(yōu)化的緩沖體系和dNTPs等，優(yōu)化了有效抑制非特異性 PCR擴增的因子和提升PCR反應(yīng)擴增效率的因子，適用于熒光標記探針的高特異性檢測系統(tǒng)。此外，Hifair® UH Ⅲ Enzymes包含比例優(yōu)化的Hifair® Ⅲ Reverse Transcriptase、RNase inhibitor及UNICON® HotStart Taq DNA Polymerase等。
產(chǎn)品組分
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組分編號 |
組分名稱 |
產(chǎn)品編號/規(guī)格 |
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11145ES50 (50 T) |
11145ES70 (200 T) |
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11145-A |
2×Hifair® Ⅲ P buffer |
500 μL |
2×1 mL |
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11145-B |
Hifair® UH Ⅲ Enzymes |
50 μL |
200 μL |
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11145-C |
Hieff® 50×High Rox |
20 μL |
80 μL |
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11145-D |
Hieff® 50×Low Rox |
20 μL |
80 μL |
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11145-E |
RNase free ddH2O |
500 μL |
2×1 mL |
【注】P buffer 為Probe buffer 的簡寫，UH 為UNICON-Hifair 的簡寫。
適用機型
High Rox 適用機型：ABI 5700, 7000, 7300, 7700, 7900HT Fast, StepOne™, StepOne Plus™
Low Rox 適用機型：ABI 7500, 7500 Fast, ViiA™7, QuantStudio™ 3 and 5, QuantStudio™ 6,7,12k Flex
Stratagene MX3000P™, MX3005P™, MX4000P™
不需要 Rox 校正的儀器型號：
Bio-Rad CFX96™, CFX384™, iCycler iQ™, iQ™5, MyiQ™, MiniOpticon™, Opticon®, Opticon® 2, Chromo4™
Eppendorf Mastercycler® ep realplex, realplex 2 s; Qiagen Corbett Rotor-Gene® Q, Rotor-Gene® 3000, Rotor-Gene® 6000
Roche Applied Science LightCycler® 480, LightCycler® 2.0; Lightcycler® 96
Thermo Scientific PikoReal Cycler; Cepheid SmartCycler®; Illumina Eco qPCR
運輸和保存方法
冰袋運輸。-20℃避光保存，有效期1年。本品避免反復(fù)凍融。建議分裝保存。
注意事項
1. 實驗過程中請使用 RNase free 耗材。
2. 為了您的安全和健康，請穿實驗服并佩戴一次性手套操作。
反應(yīng)體系（以 20 μL為例）
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組分 |
加入量 |
終濃度 |
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2×Hifair® Ⅲ P buffer |
10 μL |
1× |
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Hifair® UH Ⅲ Enzymes |
1 μL |
- |
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Hieff® 50×High Rox or Low Rox |
0.4 μL |
- |
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Gene Specific Primer Forward (10 µM) |
0.4 μL |
0.2 μM |
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Gene Specific Primer Reverse (10 µM) |
0.4 μL |
0.2 μM |
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TaqMan Probe (10 µM) |
0.2 μL |
0.1 μM |
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模板 RNA |
Total RNA: 1 pg-1 µg |
- |
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RNase free ddH2O |
to 20 μL |
- |
【注】:
a 所有試劑使用前應(yīng)充分混勻。
b 參比染料：Rox的添加，可根據(jù)不同儀器型號進行選擇，具體可參考【適用機型】。
c 引物濃度：通常引物終濃度為0.2 μM，也可以根據(jù)情況在0.1-1.0 μM之間進行調(diào)整。
d 探針濃度：探針終濃度可在50 nM-250 nM之間調(diào)整。
e 體系配制：請于超凈工作臺內(nèi)配制，并使用無核酸酶殘留的槍頭、反應(yīng)管；推薦使用帶濾芯的槍頭。避免交叉污染和氣溶膠污染。
f 模板稀釋：一步法RT-qPCR靈敏度極高，推薦將模板稀釋后(如稀釋至2-5 μL/樣本)加入反應(yīng)體系中，這樣可以有效提高實驗的重復(fù)性。
g 反應(yīng)體系：建議以大體系進行實驗，如20 μL或50 μL。
標準擴增程序
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反應(yīng)階段 |
溫度 |
時間 |
循環(huán)數(shù) |
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1 |
逆轉(zhuǎn)錄 |
50℃a |
15 minb |
1 |
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2 |
預(yù)變性 |
95℃ |
30 sec |
1 |
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3 |
擴增反應(yīng) |
95℃ |
10 sec |
45 cycles |
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60℃ |
30 secc |
【注】:
a 對于含復(fù)雜二級結(jié)構(gòu)或高GC含量的RNA模板，可將逆轉(zhuǎn)錄溫度提高到55℃，有助于提升擴增效率和靈敏度。
b 逆轉(zhuǎn)錄時間可以根據(jù)模板的復(fù)雜程度進行調(diào)整，時間為5min時可滿足大多數(shù)基因的鑒定。
c 不同的qPCR檢測儀器所需的熒光信號采集時間不同，請根據(jù)最短時間限制進行設(shè)置。
HB220304
