產(chǎn)品簡(jiǎn)介

 

螢火蟲螢光素酶（Firefly luciferase）是一種分子量約為61 kDa的蛋白，在ATP、鎂離子和氧氣存在的條件下，能夠催化螢光素（luciferin）氧化成oxyluciferin，在氧化的過(guò)程中會(huì)發(fā)出波長(zhǎng)為560 nm左右的生物熒光。海腎螢光素酶（Renilla luciferase）是一種分子量約為36 kDa的蛋白，在氧氣存在的條件下，可以催化腔腸素（coelenterazine）氧化成coelenteramide，在氧化的過(guò)程中會(huì)發(fā)出波長(zhǎng)為480nm左右的生物熒光。兩種生物熒光都可通過(guò)化學(xué)發(fā)光儀進(jìn)行測(cè)定。檢測(cè)原理如圖所示：

 

圖1：螢火蟲和海腎螢光素酶檢測(cè)原理圖

Dual One Step Luciferase Reporter Gene Assay Kit是一種輝光型雙螢光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒，具有高靈敏度和發(fā)光信號(hào)穩(wěn)定的特點(diǎn)。本試劑盒中含有高純度的螢火蟲螢光素和腔腸素，在同一個(gè)樣品中先以螢火蟲螢光素為底物檢測(cè)螢火蟲螢光素酶，后淬滅螢火蟲螢光素酶的螢光信號(hào)，并同時(shí)以腔腸素為底物檢測(cè)海腎螢光素酶，實(shí)現(xiàn)雙螢光素酶報(bào)告基因檢測(cè)。海腎螢光素酶作為內(nèi)參，消除了因孔間細(xì)胞數(shù)量、轉(zhuǎn)染效率不同等造成的影響，使得檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性更高。

相對(duì)于閃光型Dual Luciferase Reporter Gene Assay Kit（Cat NO.11402ES），本品具有以下優(yōu)點(diǎn)：1）發(fā)光信號(hào)更穩(wěn)定性，為實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)提供了更大的靈活性。2）更符合高通量檢測(cè)，無(wú)需依賴自動(dòng)進(jìn)樣器，并且無(wú)需棄培養(yǎng)液、離心等步驟，大大的簡(jiǎn)化了實(shí)驗(yàn)流程。3）無(wú)明顯刺激性氣味。本試劑盒可用于多種常用細(xì)胞培養(yǎng)液：RPMI 1640、DMEM 、MEM-α、F12、DMEM/F12等，其半衰期均為2h左右（22℃），滿足絕大多數(shù)高通量實(shí)驗(yàn)需求。

 

組分信息

 

組分編號(hào)	組分名稱	11405ES60	11405ES80
11405-A	D-輝光型螢火蟲螢光素酶緩沖液	10ml	100ml
11405-B	D-輝光型螢火蟲螢光素酶底物	1vial	1vial
11405-C	D-輝光型海腎螢光素酶緩沖液	10ml	100ml
11405-D	D-輝光型海腎螢光素酶底物(100×)	100μl	1ml

 

儲(chǔ)存條件

 

-25~-15℃保存，有效期1年。

 

使用說(shuō)明

 

1.需自備的材料

單/多道移液器；不透光細(xì)胞培養(yǎng)白板；化學(xué)發(fā)光儀或帶化學(xué)發(fā)光檢測(cè)模塊的酶標(biāo)儀。

2.檢測(cè)試劑準(zhǔn)備

1）螢火蟲螢光素酶檢測(cè)試劑：首次使用時(shí)將D-輝光型螢火蟲螢光素酶緩沖液一次性全部倒入D-輝光型螢火蟲螢光素酶底物瓶中，充分混勻直至底物完全溶解。按使用需求分裝，建議-70℃長(zhǎng)期保存或-20℃保存不超過(guò)一個(gè)月。

2）海腎螢光素酶檢測(cè)試劑：根據(jù)實(shí)際使用量，以100:1的比例將適量的D-輝光型海腎螢光素酶緩沖液與D-輝光型海腎螢光素酶底物(100×) 混勻，室溫避光備用（例如：如果需要100 ml緩沖液，則需要加入1 ml的底物），建議現(xiàn)配現(xiàn)用。

注：1）兩種緩沖液都可以4℃，室溫或水浴融化，但溫度不能超過(guò)25℃。

2）D-輝光型海腎螢光素酶底物(100×)，每次開蓋前需進(jìn)行短暫低速離心。

3.操作步驟

1）從細(xì)胞培養(yǎng)箱中取出含哺乳動(dòng)物細(xì)胞的培養(yǎng)板，放置5-15 min，平衡至室溫。

2）螢火蟲螢光素酶活性檢測(cè)：

①加入與待測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)液等體積并平衡至室溫的螢火蟲螢光素酶檢測(cè)試劑（例如，96孔板建議加入80 μl培養(yǎng)液，相應(yīng)加入80 μl檢測(cè)試劑；384孔板通常加入20 μl培養(yǎng)液，相應(yīng)加入20 μl檢測(cè)試劑）。

②在水平搖床上室溫混勻至少10 min。（注：不要用移液器吹吸混勻，產(chǎn)生的氣泡會(huì)影響發(fā)光檢測(cè)讀數(shù)。）

③在化學(xué)發(fā)光檢測(cè)儀或帶化學(xué)發(fā)光模塊的多功能酶標(biāo)儀上檢測(cè)螢火蟲螢光素酶發(fā)光信號(hào)，加入檢測(cè)試劑后2 h內(nèi)完成檢測(cè)。

3）海腎螢光素酶活性檢測(cè)：

①加入平衡至室溫的海腎螢光素酶檢測(cè)試劑，加樣體積與初始細(xì)胞培養(yǎng)液體積相同并充分混勻。（例如，96孔板建議加入80 μl培養(yǎng)液，相應(yīng)加入80 μl檢測(cè)試劑；384孔板通常加入20 μl培養(yǎng)液，相應(yīng)加入20 μl檢測(cè)試劑）。

②在水平搖床上室溫混勻至少10 min。

③在化學(xué)發(fā)光檢測(cè)儀或帶化學(xué)發(fā)光模塊的多功能酶標(biāo)儀上檢測(cè)海腎螢光素酶發(fā)光信號(hào)，加入檢測(cè)試劑后2 h內(nèi)完成檢測(cè)。海腎螢光素酶在微孔板上的檢測(cè)順序應(yīng)與螢火蟲螢光素酶的檢測(cè)順序相同。

4）數(shù)據(jù)分析：

①實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)：根據(jù)不同實(shí)驗(yàn)?zāi)康?，在每個(gè)培養(yǎng)板中都應(yīng)設(shè)置空白對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組。

a.空白對(duì)照組

背景F：未轉(zhuǎn)染細(xì)胞+螢火蟲螢光素酶檢測(cè)試劑。

背景R：未轉(zhuǎn)染細(xì)胞+螢火蟲螢光素酶檢測(cè)試劑+海腎螢光素酶檢測(cè)試劑。

注：用于空白對(duì)照組樣品量必須與實(shí)驗(yàn)樣品量相同，并且包含與實(shí)驗(yàn)樣品相同的培養(yǎng)基/血清組合。

b.實(shí)驗(yàn)組：轉(zhuǎn)染細(xì)胞經(jīng)實(shí)驗(yàn)化合物處理(即實(shí)驗(yàn)組F和實(shí)驗(yàn)組R)。

c.對(duì)照組：轉(zhuǎn)染細(xì)胞不經(jīng)處理，用以標(biāo)準(zhǔn)化結(jié)果(即對(duì)照組F和對(duì)照組R)。

②計(jì)算結(jié)果：實(shí)驗(yàn)組比值=(實(shí)驗(yàn)組F-背景F）/(實(shí)驗(yàn)組R-背景R)，對(duì)照組比值=(對(duì)照組F-背景F）/(對(duì)照組R-背景R)。

表達(dá)倍數(shù)=實(shí)驗(yàn)組比值/對(duì)照組比值。

 

注意事項(xiàng)

 

1）反應(yīng)溫度：酶促反應(yīng)對(duì)溫度較為敏感，加樣檢測(cè)前務(wù)必將檢測(cè)試劑以及細(xì)胞培養(yǎng)液平衡至室溫（20-25℃）。

2）檢測(cè)儀器：能檢測(cè)化學(xué)發(fā)光的儀器都適用，但由于不同儀器的設(shè)置和靈敏度不同，測(cè)得的光信號(hào)值也會(huì)不同。

3）檢測(cè)板：為防止孔間干擾，推薦使用不透光細(xì)胞培養(yǎng)白板。

4）檢測(cè)設(shè)置：Luminescence，350-700 nm，建議讀板時(shí)間設(shè)為0.5-1 sec。

5）發(fā)光信號(hào)會(huì)受到檢測(cè)環(huán)境如培養(yǎng)基組分、溫度等影響，應(yīng)確保同組內(nèi)不同樣本檢測(cè)條件一致。

6）本產(chǎn)品僅作科研用途。

7）為了您的安全和健康，請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套。

 

 

Ver.CN20250228