Hieff Trans^® siRNA/miRNA體外轉(zhuǎn)染試劑是一種非脂質(zhì)體PEI陽離子、兩性分子轉(zhuǎn)染試劑，為siRNA轉(zhuǎn)染到哺乳動物細(xì)胞中而開發(fā)。適用于siRNA和miRNA的轉(zhuǎn)染。這種轉(zhuǎn)染試劑包裹siRNA或miRNA形成陽離子復(fù)合物，該復(fù)合物與細(xì)胞表面帶負(fù)電的蛋白聚糖相互作用吸附在細(xì)胞表面，通過內(nèi)吞進(jìn)入細(xì)胞，形成內(nèi)含體。該轉(zhuǎn)染試劑具有質(zhì)子海綿的作用，能夠吸收溶酶體中的H⁺，質(zhì)子的不斷流入，導(dǎo)致復(fù)合體腫脹破裂，從而使外源siRNA或miRNA釋放到細(xì)胞質(zhì)中。

該產(chǎn)品可在廣泛的細(xì)胞系中，實(shí)現(xiàn)siRNA超過90%的表達(dá)效率，避免了脫靶效應(yīng)。適用于多種細(xì)胞轉(zhuǎn)染，包括Hela、MCF-7、HepG2、CHO等貼壁細(xì)胞；以及難以轉(zhuǎn)染的懸浮細(xì)胞系，如K562或THP-1細(xì)胞，可達(dá)到80%的沉默效率；同時(shí)還包括一些原代細(xì)胞，原代人成纖維細(xì)胞和原代人肝細(xì)胞等，可達(dá)到80%的沉默效率。

 

運(yùn)輸與保存方法

冰袋（wet ice）運(yùn)輸。產(chǎn)品2-8 ℃保存，一年有效。不可冷凍！

 

注意事項(xiàng) 

1）整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程使用無RNA酶和無熱原性的材料，如離心管、槍頭、緩沖液。

2）轉(zhuǎn)染前，確保siRNA是經(jīng)過PAGE純化和脫鹽處理過的，高純度的siRNA或者miRNA有助于獲得較高的轉(zhuǎn)染效率。

3）PEI陽離子轉(zhuǎn)染試劑應(yīng)該在2-8 ℃保存，要注意避免多次反復(fù)長時(shí)間開蓋，否則可能會導(dǎo)致PEI揮發(fā)，降低轉(zhuǎn)染效率。

4）轉(zhuǎn)染前一天，確保接種貼壁細(xì)胞密度在30%-50%左右，對于一些小細(xì)胞和生長緩慢的細(xì)胞，接種密度可適當(dāng)擴(kuò)大2倍。

5）轉(zhuǎn)染前，確保siRNA/miRNA基因沉默表達(dá)不會影響細(xì)胞活力。

6）該產(chǎn)品只適合體外轉(zhuǎn)染，不能用于體內(nèi)轉(zhuǎn)染。

7）本產(chǎn)品僅作科研用途！

 

操作流程

一．貼壁細(xì)胞轉(zhuǎn)染（以24孔板和終濃度50 nM siRNA為例，其他培養(yǎng)板加樣體積請參考表1）
接種貼壁細(xì)胞

1.為了提高轉(zhuǎn)染效率，建議在轉(zhuǎn)染前一天接種細(xì)胞，接種細(xì)胞密度建議30%-50%左右，建議初次使用時(shí)設(shè)置梯度進(jìn)行優(yōu)化最佳使用量。

2.按照以下體系配制siRNA-PEI或miRNA-PEI核酸轉(zhuǎn)染試劑陽離子復(fù)合物： 

1）對于每孔細(xì)胞，使用100 μL無血清培養(yǎng)基（如OPTI-MEM培養(yǎng)基）稀釋30 pmoles siRNA，混勻。

2）立刻向100 μL的siRNA中加入2-4 μL的轉(zhuǎn)染試劑，旋渦10秒，充分混勻。

3）在室溫下孵育10 min，使得形成siRNA-PEI陽離子核酸轉(zhuǎn)染試劑復(fù)合物。
【注】：孵育時(shí)間不要超過30min

4）在形成復(fù)合物過程中，移除細(xì)胞生長培養(yǎng)基，每孔中加入500 μL新鮮預(yù)熱的完全培養(yǎng)基。

5）直接將100 µL siRNA-PEI陽離子核酸轉(zhuǎn)染試劑復(fù)合物加入細(xì)胞中，搖動培養(yǎng)板，輕輕混勻。最終體積為600 µL ，siRNA終濃度為50 nM。

6）37 ℃，5% CO₂培養(yǎng)箱培養(yǎng)，直至目的基因表達(dá)。建議一般siRNA表達(dá)水平通常在24-72 h，蛋白表達(dá)水平在48-96 h。

圖1 轉(zhuǎn)染貼壁細(xì)胞操作流程

表1 siRNA終濃度為50 nM時(shí)，轉(zhuǎn)染試劑、培養(yǎng)基的用量參考值（貼壁細(xì)胞）

培養(yǎng)皿	每孔培養(yǎng)基體積	稀釋用無血清培養(yǎng)基	siRNA物質(zhì)的量(pmoles)	轉(zhuǎn)染試劑體積（µL）	加入復(fù)合物后培養(yǎng)基總體積
96孔板	125 µL	50 µL	8.75	0.5-1.5	175 µL
24孔板	500 µL	100 µL	30	2-4	600 µL
12孔板	1 mL	200 µL	60	4-8	1.2 mL
6孔板	2 mL	200 µL	110	8-16	2.2 mL
25cm2培養(yǎng)瓶	4 mL	400 µL	220	15-25	4.4 mL

注：貼壁細(xì)胞培養(yǎng)密度與各細(xì)胞倍增時(shí)間有關(guān)，確保細(xì)胞轉(zhuǎn)染時(shí)細(xì)胞密度在60-80%即可。

二．懸浮細(xì)胞轉(zhuǎn)染（以24孔板和終濃度50 nM siRNA為例，其他培養(yǎng)板加樣體積請參考表2）
接種細(xì)胞

1.為了優(yōu)化懸浮細(xì)胞轉(zhuǎn)染條件，與貼壁細(xì)胞相比，需要降低懸浮細(xì)胞培養(yǎng)基的體積。根據(jù)培養(yǎng)皿大小和完整培養(yǎng)基的體積，推薦接種懸浮細(xì)胞的數(shù)量如下表2所示。

表2 siRNA終濃度為50 nM時(shí)，轉(zhuǎn)染試劑、培養(yǎng)基的用量參考值（懸浮細(xì)胞）

培養(yǎng)皿	siRNA物質(zhì)的量(pmoles)	轉(zhuǎn)染試劑體積（µL）	轉(zhuǎn)染當(dāng)天接種細(xì)胞數(shù)	形成復(fù)合物培養(yǎng)基體積	轉(zhuǎn)染前懸浮細(xì)胞的體積	轉(zhuǎn)染4-6h后另加入培養(yǎng)基的體積
96孔板	5	0.5-1.5	1×104~ 2×104	50 µL	50 µL	100 µL
24孔板	15	2-4	1×105 ~ 2×105	100 µL	200 µL	700 µL
12孔板	35	4-8	2×105 ~ 4×105	200 µL	500 µL	1 mL
6孔板	60	8-16	5×105 ~ 2×106	200 µL	1 mL	2 mL
25cm2培養(yǎng)瓶	120	15-25	2×106~ 5×106	400 µL	2 mL	4 mL