Hieff NGS^® Ultima DNA Library Prep Kit for MGI^®是針對(duì)MGI^®高通量測(cè)序平臺(tái)定向優(yōu)化而成的新一代建庫(kù)試劑盒。作為全新的升級(jí)版本，本產(chǎn)品采用高質(zhì)量的酶學(xué)組成，簡(jiǎn)化的操作流程，可顯著提高低質(zhì)量樣本文庫(kù)轉(zhuǎn)化率與擴(kuò)增效率，具有廣泛的樣本適應(yīng)性，同時(shí)兼容FFPE、cfDNA、ChIP DNA等樣本，助力獲得優(yōu)異的測(cè)序數(shù)據(jù)。

• 適用500 pg-1 μg DNA樣本
• 兼容cfDNA、FFPE等低質(zhì)量樣本
• 高效的文庫(kù)轉(zhuǎn)化率與擴(kuò)增效率
• 多樣本驗(yàn)證可獲得優(yōu)異的文庫(kù)與測(cè)序數(shù)據(jù)
• 嚴(yán)格的批次性能與穩(wěn)定性質(zhì)控

產(chǎn)品組分

組分編號(hào)與名稱(chēng)		13310ES96	13310ES98
13310-A	Endprep Mix	960 μL	2×960 μL
13310-B	Ligation Enhancer	4×720 μL	6×960 μL
13310-C	Fast T4 DNA Ligase	480 μL	960 μL
13310-D	2×Ultima HF Amplification Mix	4×600 μL	5×960 μL
13310-E	Primer Mix for MGI®	480 μL	960 μL

運(yùn)輸與保存方法

-25~-15℃保存，有效期1年。

注意事項(xiàng)

一、關(guān)于操作

1. 為了您的安全和健康，請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。

2. 請(qǐng)于使用前將試劑盒各組分置于室溫解凍。解凍后上下顛倒數(shù)次充分混勻，短暫離心后置于冰上待用。

3. 配制各步驟反應(yīng)液時(shí)推薦使用移液器吹打混勻或輕輕振蕩，劇烈振蕩可能會(huì)造成文庫(kù)產(chǎn)出下降。

4. 為避免樣品交叉污染，推薦使用帶濾芯的槍頭，吸取不同樣品時(shí)請(qǐng)更換槍頭。

5. 推薦在帶熱蓋的PCR儀中進(jìn)行各步驟反應(yīng)，使用前應(yīng)預(yù)熱PCR儀至反應(yīng)溫度附近。

6. PCR產(chǎn)物因操作不當(dāng)極容易產(chǎn)生氣溶膠污染，進(jìn)而影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確性。推薦將PCR反應(yīng)體系配制區(qū)和PCR產(chǎn)物純化檢測(cè)區(qū)進(jìn)行強(qiáng)制性的物理隔離；使用專(zhuān)用的移液器等設(shè)備；并定時(shí)對(duì)各實(shí)驗(yàn)區(qū)域進(jìn)行清潔（使用0.5%次氯酸鈉或10%漂白劑進(jìn)行擦拭清理），以保證實(shí)驗(yàn)環(huán)境的潔凈度。

7.本產(chǎn)品僅用作科研用途！

二、關(guān)于DNA片段化

1. 本試劑盒中兼容機(jī)械法及酶切法片段化的DNA。

2. 本試劑盒兼容范圍為500 pg – 1 μg Input DNA。應(yīng)盡可能使用A₂₆₀/A₂₈₀ = 1.8-2.0的高質(zhì)量Input DNA。表1中列舉了將本試劑盒應(yīng)用于常見(jiàn)應(yīng)用中推薦的Input DNA量。

表1  常見(jiàn)應(yīng)用中推薦Input DNA量

應(yīng)用	樣本類(lèi)型	推薦Input DNA量
全基因組測(cè)序	復(fù)雜基因組	50 ng-1 μg
靶向捕獲測(cè)序	復(fù)雜基因組	10 ng-1 μg
全基因組測(cè)序，靶向捕獲測(cè)序	FFPE DNA	≥50 ng
全基因組測(cè)序，靶向捕獲測(cè)序	cfDNA/ctDNA	≥500 pg
全基因組測(cè)序	微生物基因組	≥1 ng
全基因組測(cè)序PCR-free測(cè)序	高質(zhì)量DNA	≥100 ng
免疫共沉淀測(cè)序	ChIP-DNA	≥500 pg
靶向測(cè)序	擴(kuò)增子	≥500 pg

【注】：上表為使用高質(zhì)量DNA時(shí)推薦的Input DNA量，當(dāng)Input DNA質(zhì)量較差或需要進(jìn)行片段分選時(shí)，應(yīng)適當(dāng)上調(diào)使用量。

3. Input DNA特指投入末端修復(fù)/dA尾添加步驟中的DNA。

4. Input DNA制備過(guò)程中帶入的高濃度金屬離子螯合劑或其他鹽，可能會(huì)影響末端修復(fù)/dA尾添加步驟反應(yīng)效率，建議DNA片段化后進(jìn)行磁珠純化或分選。當(dāng)使用機(jī)械法進(jìn)行DNA片段化且產(chǎn)物不進(jìn)行純化或長(zhǎng)度分選而直接建庫(kù)時(shí)，請(qǐng)將DNA稀釋在TE Buffer中進(jìn)行片段化，請(qǐng)勿在滅菌超純水中進(jìn)行。當(dāng)使用酶切法進(jìn)行片段化且產(chǎn)物不進(jìn)行純化或長(zhǎng)度分選而直接建庫(kù)時(shí)，請(qǐng)確認(rèn)Stop Buffer中不包含過(guò)量的金屬離子螯合劑。如條件不滿(mǎn)足，可先將片段化產(chǎn)物純化或長(zhǎng)度分選后溶于TE buffer或滅菌超純水中（≤50 μL），再進(jìn)行文庫(kù)構(gòu)建。

三、關(guān)于接頭連接（Adapter Ligation）

1.目前華大智造有2種序號(hào)的接頭：1-128和501-596。關(guān)于其使用要求，請(qǐng)?jiān)斠?jiàn)華大智造“關(guān)于Adapter使用”有關(guān)說(shuō)明或咨詢(xún)本公司。此外，華大智造申明：2種接頭由于設(shè)計(jì)工藝不同，禁止混用，否則測(cè)序數(shù)據(jù)無(wú)法拆分！

2. Adapter的質(zhì)量和使用濃度直接影響連接效率及文庫(kù)產(chǎn)量。請(qǐng)按照表2和實(shí)際DNA投入量確實(shí)確定接頭用量，需要稀釋接頭時(shí)，請(qǐng)用TE buffer對(duì)接頭進(jìn)行稀釋。

Input DNA	10μM Adapter稀釋倍數(shù)	稀釋后投入量（μL）
31ng-1 μg	不稀釋	5
11-30 ng	5	5
3-10 ng	10	5
0.5-2 ng	20	5

表2  500pg-1 μg Input DNA推薦的Adapter使用量

四、關(guān)于磁珠純化與分選（Bead-based Clean Up and Size Selection）

1. DNA片段長(zhǎng)度分選步驟可選擇在末端修復(fù)/dA尾添加之前，或接頭連接后，或文庫(kù)擴(kuò)增后進(jìn)行。

2. 當(dāng)Input DNA質(zhì)量≥50 ng，您可選擇在接頭連接后分選；如Input DNA質(zhì)量<50 ng，建議您在文庫(kù)擴(kuò)增后進(jìn)行分選。

3. Ligation Enhancer中包含高濃度的PEG，會(huì)對(duì)雙輪磁珠分選產(chǎn)生顯著影響。因此，如在接頭連接后進(jìn)行長(zhǎng)度分選，必須先進(jìn)行純化步驟，再進(jìn)行雙輪分選步驟；如在末端修復(fù)/dA尾添加之前或文庫(kù)擴(kuò)增后進(jìn)行長(zhǎng)度分選，可直接進(jìn)行雙輪磁珠分選步驟。

4. 磁珠使用前應(yīng)先平衡至室溫，否則會(huì)導(dǎo)致得率下降、分選效果不佳。

5. 磁珠每次使用前都應(yīng)充分振蕩混勻或使用移液器上下吹打充分混勻。

6. 轉(zhuǎn)移上清時(shí)，請(qǐng)勿吸取磁珠，即使微量殘留都將影響后續(xù)文庫(kù)質(zhì)量。

7. 磁珠漂洗使用的80%乙醇應(yīng)現(xiàn)用現(xiàn)配，否則將影響回收效率。

8. 進(jìn)行長(zhǎng)度分選時(shí)，初始樣品體積應(yīng)盡量≥100 μL，不足時(shí)請(qǐng)用超純水補(bǔ)齊。以防因樣品體積太小導(dǎo)致移液誤差增大。

9. 產(chǎn)物洗脫前應(yīng)將磁珠置于室溫干燥。干燥不充分容易造成無(wú)水乙醇?xì)埩粲绊懞罄m(xù)反應(yīng)；過(guò)分干燥又會(huì)導(dǎo)致磁珠開(kāi)裂進(jìn)而降低純化得率。通常情況下，室溫干燥3-5 min足以讓磁珠充分干燥。

10. DNA純化或長(zhǎng)度分選產(chǎn)物如需保存，可使用TE Buffer洗脫，產(chǎn)物可于4°C可保存1-2周，-20°C可保存1個(gè)月。

五、關(guān)于文庫(kù)擴(kuò)增（Library Amplification）

1. 是否需要進(jìn)行文庫(kù)擴(kuò)增取決于Input DNA量、應(yīng)用需要等因素。當(dāng)Input DNA<200 ng時(shí)，推薦進(jìn)行文庫(kù)擴(kuò)增；當(dāng)Input DNA≥200 ng或者不需要進(jìn)行文庫(kù)擴(kuò)增時(shí)，可不進(jìn)行文庫(kù)擴(kuò)增。

2. 文庫(kù)擴(kuò)增步驟需要嚴(yán)格控制擴(kuò)增循環(huán)數(shù)。循環(huán)數(shù)不足，將導(dǎo)致文庫(kù)產(chǎn)量低；循環(huán)數(shù)過(guò)多，又將導(dǎo)致文庫(kù)偏好性增加、重復(fù)度增加、嵌合產(chǎn)物增加、擴(kuò)增突變積累等多種不良后果。表3列舉了本試劑盒，獲得100 ng或1000 ng文庫(kù)的所需循環(huán)數(shù)。

表3  500 pg-1 μg Input DNA獲得100 ng或1000 ng產(chǎn)物擴(kuò)增循環(huán)數(shù)推薦表

Input DNA ( Into End Preparation )	Number of cycles required to generate
	100 ng	1000 ng
1 μg	0	3 - 4
500 ng	0	4 - 5
250 ng	1 - 4	5 - 7
100 ng	2 - 5	6 - 8
50 ng	4 - 7	8- 10
10 ng	6 - 8	9 - 12
5 ng	7 - 10	11 - 14
1 ng	9 - 11	12 - 15
500 pg	11 - 13	14 - 16

【注】：建庫(kù)過(guò)程中進(jìn)行過(guò)長(zhǎng)度分選時(shí)參照較高循環(huán)數(shù)擴(kuò)增。

六、關(guān)于文庫(kù)質(zhì)檢（Library Quality Analysis）

1. 通常情況下，構(gòu)建好的文庫(kù)可通過(guò)長(zhǎng)度分布檢測(cè)和濃度檢測(cè)來(lái)進(jìn)行質(zhì)量評(píng)價(jià)。

2. 文庫(kù)濃度檢測(cè)可使用：基于雙鏈DNA熒光染料的方法，如Qubit^®、PicoGreen^®等；基于qPCR絕對(duì)定量的方法。

3. 文庫(kù)濃度檢測(cè)不可使用：基于光譜檢測(cè)的方法，如NanoDrop^®等。

4. 推薦使用qPCR方法進(jìn)行文庫(kù)濃度檢測(cè)：Qubit^®、PicoGreen^®等基于雙鏈DNA熒光染料的濃度測(cè)定方法時(shí)，無(wú)法有效區(qū)分單端連接Adapter的產(chǎn)物、兩端均未連接Adapter的產(chǎn)物以及其他不完整雙鏈結(jié)構(gòu)產(chǎn)物；qPCR絕對(duì)定量基于PCR擴(kuò)增原理，僅定量樣品中兩端Adapter完整的文庫(kù)（即可測(cè)序的文庫(kù)），可排除單端或雙端都不連接Adapter的不可測(cè)序文庫(kù)的干擾。

5. 文庫(kù)長(zhǎng)度分布檢測(cè)，可通過(guò)Agilent Bioanalyzer 2100等基于毛細(xì)管電泳或微控流原理的設(shè)備進(jìn)行檢測(cè)。

使用方法

一、自備材料

1. 純化磁珠：Cat#12601，Hieff NGS^® DNA Selection Beads或Cat#A63880，AMPure XP Beads或其他等效產(chǎn)品。

2. DNA質(zhì)控：Agilent Technologies 2100 Bioanalyzer或其他等效產(chǎn)品。

3. DNA Adapter：詳情請(qǐng)咨詢(xún)?nèi)A大智造或本公司。

4. 其他材料：無(wú)水乙醇、滅菌超純水、TE Buffer（10 mM Tris-HCl，pH 8.0-8.5+0.1 mM EDTA）、低吸附EP管、PCR管、磁力架、PCR儀等。

二、操作流程

 

圖1  Ultima DNA建庫(kù)試劑盒操作流程

三、操作步驟

3.1 末端修復(fù)/dA尾添加（End Preparation/dA-Taling）

該步驟將Input DNA末端補(bǔ)平，并進(jìn)行5’端磷酸化和3’端加dA尾。

1. 將表4中各試劑解凍后，顛倒混勻，置于冰上備用。

2. 于無(wú)菌PCR管中配制表4所示反應(yīng)體系。

表4  末端修復(fù)/dA尾添加PCR反應(yīng)體系

名稱(chēng)	體積（μL）
Fragmented DNA	x
Endprep Mix	10
ddH2O	Up to 60 μL

3. 使用移液器輕輕吹打或振蕩混勻，并短暫離心將反應(yīng)液離心至管底。

4. 將上述PCR管置于PCR儀，設(shè)置表5所示反應(yīng)程序，進(jìn)行末端修復(fù)/dA尾添加反應(yīng)。

表5  末端修復(fù)/dA尾添加PCR反應(yīng)程序

溫度	時(shí)間
熱蓋105°C	On
30°C	20 min
72°C	20 min
4°C	Hold

3.2 接頭連接（Adapter Ligation）

該步驟將3.1步驟的產(chǎn)物末端，連接特定的MGI^®接頭。

1. 根據(jù)Input DNA量按表2稀釋Adapter至合適濃度。

2. 將表6中各試劑解凍后顛倒混勻，置于冰上備用。

3. 于3.1步驟PCR管中配制表6所示反應(yīng)體系。

表6  Adapter Ligation PCR體系

名稱(chēng)	體積（μL）
dA-tailed DNA（3.1步驟產(chǎn)物）	60
Ligation Enhancer	30*
Fast T4 DNA Ligase	5
DNA Adapter	5

【注】：*Ligation Enhancer比較粘稠，請(qǐng)上下顛倒、振蕩，充分混勻并瞬時(shí)后離心使用。

4. 使用移液器輕輕吹打或振蕩混勻，并短暫離心將反應(yīng)液收集至管底。

5. 將PCR管置于PCR儀中，設(shè)置表7所示反應(yīng)程序，進(jìn)行接頭連接反應(yīng)：

表7  Adapter Ligation PCR反應(yīng)程序

溫度	時(shí)間
熱蓋105°C	Off
20°C	15 min
4°C	Hold

【注】：當(dāng)Input DNA量較低，實(shí)驗(yàn)效果不理想時(shí)，可嘗試將連接時(shí)間延長(zhǎng)一倍。

3.3 連接產(chǎn)物磁珠純化（Post Ligation Clean Up）

該步驟使用磁珠對(duì)3.2步驟的產(chǎn)物進(jìn)行純化或分選。純化可除去未連接的Adapter或Adapter Dimer等無(wú)效產(chǎn)物。

3.3.1 純化操作步驟：

1. 準(zhǔn)備工作：將Hieff NGS^® DNA Selection Beads磁珠由冰箱中取出，室溫平衡至少30 min。配制80%乙醇。

2. 渦旋振蕩或充分顛倒磁珠以保證充分混勻。

3. 吸取80 μL Hieff NGS^® DNA Selection Beads（0.8×，Beads:DNA=0.8:1）至Adapter Ligation產(chǎn)物中，渦旋混勻或移液器吹打10次混勻，室溫孵育5 min。

4. 將PCR管短暫離心并置于磁力架中分離磁珠和液體，待溶液澄清后（約5 min），小心移除上清。

5. 保持PCR管始終置于磁力架中，加入200 μL新鮮配制的80%乙醇漂洗磁珠，室溫孵育30 sec后，小心移除上清。

6. 重復(fù)步驟5，總計(jì)漂洗兩次。

7. 保持PCR管始終置于磁力架中，開(kāi)蓋空氣干燥磁珠至剛剛出現(xiàn)龜裂（不超過(guò)5 min）。

8. 將PCR管從磁力架中取出，進(jìn)行洗脫：

1）如產(chǎn)物無(wú)需進(jìn)行片段分選，直接加入21 μL ddH₂O，渦旋振蕩或使用移液器輕輕吹打至充分混勻，室溫靜置5 min。【注：如純化產(chǎn)物如需保存，可使用TE Buffer洗脫】。將PCR管短暫離心并置于磁力架中靜置，待溶液澄清后（約5 min），小心移取20 μL上清至新PCR管中，切勿觸碰磁珠。

2）如產(chǎn)物需進(jìn)行雙輪分選，加入102 μL ddH₂O，渦旋振蕩或使用移液器輕輕吹打至充分混勻，室溫靜置5 min?！咀ⅲ喝缂兓a(chǎn)物如需保存，可使用TE Buffer洗脫】。將PCR管短暫離心并置于磁力架中靜置，待溶液澄清后（約5 min），小心移取100 μL上清至新PCR管中，切勿觸碰磁珠。

3.3.2 雙輪分選操作步驟：

1. 準(zhǔn)備工作：將Hieff NGS^® DNA Selection Beads磁珠由冰箱中取出，室溫平衡約30 min。配制80%乙醇。

2. 請(qǐng)渦旋振蕩或充分顛倒磁珠以保證混勻。

3. 根據(jù)DNA片段長(zhǎng)度要求，參考表8向上述100 μL DNA上清中加入第一輪分選磁珠，渦旋混勻或移液器吹打10次混勻。

表8  磁珠文庫(kù)分選推薦比例

DNA文庫(kù)插入片段大小	150 - 250 bp	200-300 bp	300-400 bp
DNA文庫(kù)大小	230 - 330 bp	280-380bp	380-480bp
第一輪體積比（Beads:DNA）	0.78×	0.68×	0.58×
第二輪體積比（Beads:DNA）	0.20×	0.20×	0.20×

【注】：表中“×”表示樣品DNA體積。如文庫(kù)插入片段長(zhǎng)度為200 bp，樣品DNA體積為100 μL，則第一輪分選磁珠使用體積為0.78×100 μL=78 μL；第二輪分選磁珠使用體積為0.20×100 μL=20 μL；表中所推薦比例是針對(duì)于Adapter Ligated Insert DNA（Post Ligation），如果用戶(hù)在接頭連接前進(jìn)行分選，請(qǐng)采用Hieff NGS^® DNA Selection Beads（Cat#12601）說(shuō)明書(shū)中推薦的比例。

4. 室溫孵育5 min。

5. 將PCR管短暫離心并置于磁力架中，待溶液澄清后（約5 min），小心轉(zhuǎn)移上清到干凈的離心管中。

6. 參考表8向上清中加入第二輪分選磁珠。

7. 渦旋混勻或移液器吹打10次混勻，室溫靜置5 min。

8. 將PCR管短暫離心并置于磁力架中，待溶液澄清后（約5 min），小心移除上清。

9. 保持PCR管始終處于磁力架中，加入200 μL新鮮配制的80%乙醇漂洗磁珠，室溫孵育30 sec，小心移除上清。

10. 重復(fù)步驟9。

11. 保持PCR管始終處于磁力架中，開(kāi)蓋干燥磁珠至剛剛出現(xiàn)龜裂（約5 min）。

12. 將PCR管從磁力架中取出，加入適量21 μL ddH₂O，渦旋振蕩或使用移液器輕輕吹打充分混勻，室溫靜置5 min。

13. 將PCR管短暫離心并置于磁力架中分離磁珠和液體。待溶液澄清后（約5 min），小心轉(zhuǎn)移20 μL上清至干凈的管中。

3.4 文庫(kù)擴(kuò)增（Library Amplification）

該步驟將對(duì)純化或長(zhǎng)度分選后的接頭連接產(chǎn)物進(jìn)行PCR擴(kuò)增富集。

1. 將表9中試劑解凍后顛倒混勻，置于冰上備用。

2. 于無(wú)菌PCR管中配制表9所示反應(yīng)體系。

表9  PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系

名稱(chēng)	體積（μL）
2×Ultima HF Amplification Mix	25
Primer Mix for MGI®	5
Adapter Ligated DNA（3.3步驟產(chǎn)物）	20

3. 使用移液器輕輕吹打或振蕩混勻，并短暫離心將反應(yīng)液收集至管底。

4. 將PCR管置于PCR儀中，設(shè)置表10所示反應(yīng)程序，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

表10  PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序

溫度	時(shí)間	循環(huán)數(shù)
98°C	1 min	1
98°C	10 sec	參照注意事項(xiàng)中表3
60°C	30 sec
72°C	30 sec
72°C	5 min	1
4°C	Hold	-

3.5 擴(kuò)增產(chǎn)物磁珠純化或分選（Post Amplification Clean Up/Size Selection）

同3.3.1步驟中純化操作步驟。使用Hieff NGS^® DNA Selection Beads（0.9×，Beads:DNA=0.9:1）純化文庫(kù)擴(kuò)增產(chǎn)物。

如需分選，操作方法同3.3.2雙輪分選步驟（純化步驟可省略）。

3.6 文庫(kù)質(zhì)量控制

通常情況下，構(gòu)建好的文庫(kù)可通過(guò)濃度檢測(cè)和長(zhǎng)度分布檢測(cè)來(lái)進(jìn)行質(zhì)量評(píng)價(jià)，具體請(qǐng)參見(jiàn)注意事項(xiàng)六。

3.7 文庫(kù)環(huán)化

使用Hieff NGS^® Fast-Pace DNA Cyclization Kit for MGI^®（Cat#13341）或其他等效產(chǎn)品進(jìn)行文庫(kù)單鏈環(huán)化反應(yīng)。

3.8 參考實(shí)例

使用Hieff NGS^® Ultima DNA Library Prep Kit for MGI^®對(duì) 50 ng E.coli超聲樣本建庫(kù)，結(jié)果使用Agilent Bioanalyzer 2100進(jìn)行檢測(cè)。

圖2  Ultima DNA建庫(kù)試劑盒樣本及PCR純化產(chǎn)物（分選前后）Agilent 2100 檢測(cè)結(jié)果