產(chǎn)品簡(jiǎn)介

 

YeaCell^TM單細(xì)胞純化試劑盒包括單細(xì)胞乳濁液純化試劑、cDNA純化磁珠以及DNA純化分選磁珠。本試劑盒中的磁珠在回收核酸方面可實(shí)現(xiàn)更高的靈敏度和更好的性能，獲得的核酸產(chǎn)量高，穩(wěn)定性強(qiáng)，均一性好。

 

組分信息

 

組分編號(hào)		組分名稱	12521ES02	12521ES08	12521ES16	12521ES96
BOX-I	12521-A	Dynabeads MyOne SILANE	16 μL	64 μL	128 μL	768 μL
	12521-B	Cleanup Buffer	375 μL	2×750 μL	4×750 μL	18 mL
	12521-C	cDNA Clean Beads	120 μL	480 μL	960 μL	5.76 mL
	12521-D	DNA Clean Beads	400 μL	2×800 μL	4×800 μL	19.2 mL
BOX-II	12521-E	Reducing Agent	100 μL	400 μL	800 μL	3×960 μL

 

儲(chǔ)存條件

 

Box I:2~8℃保存,Box II-25℃~ -15℃保存。有效期1年。

 

使用說(shuō)明

 

注意事項(xiàng)

1.關(guān)于操作

1）為了您的安全和健康，請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。

2）請(qǐng)于使用前將試劑盒各組分置于室溫平衡。使用前上下顛倒數(shù)次充分混勻，短暫離心后置于室溫備用。

3）產(chǎn)品組分使用完后，請(qǐng)盡快放置于4℃條件下進(jìn)行保存。

4）請(qǐng)使用無(wú)RNase污染的耗材，并對(duì)實(shí)驗(yàn)區(qū)域定期進(jìn)行清理，推薦使用ThermoFisher公司的RNAZap^TM高效核酸去除噴霧去除RNA酶污染。

5）PCR產(chǎn)物因操作不當(dāng)極容易產(chǎn)生氣溶膠污染，進(jìn)而影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確性。推薦將PCR反應(yīng)體系配制區(qū)和PCR產(chǎn)物純化檢測(cè)區(qū)進(jìn)行強(qiáng)制性的物理隔離；配備文庫(kù)構(gòu)建專用移液器等設(shè)備；定時(shí)對(duì)各實(shí)驗(yàn)區(qū)域進(jìn)行清潔（推薦使用ThermoFisher公司的DNAZap^TM高效核酸去除噴霧），以保證實(shí)驗(yàn)環(huán)境的潔凈度。

6）本產(chǎn)品僅作科研用途！

2.磁珠純化與分選

1）建庫(kù)過(guò)程中有多個(gè)步驟需要使用純化磁珠進(jìn)行純化和分選。

2）磁珠使用前應(yīng)先平衡至室溫，否則會(huì)導(dǎo)致得率下降、分選效果不佳。

3）磁珠每次使用前都應(yīng)充分振蕩混勻或使用移液器上下吹打充分混勻。

4）轉(zhuǎn)移上清時(shí)，請(qǐng)勿吸取磁珠，即使微量殘留都將影響后續(xù)文庫(kù)質(zhì)量。

5）磁珠洗滌使用的80%乙醇應(yīng)現(xiàn)用現(xiàn)配，否則將影響回收效率。

6）產(chǎn)物洗脫前應(yīng)將磁珠置于室溫干燥。干燥不充分容易造成無(wú)水乙醇?xì)埩粲绊懞罄m(xù)反應(yīng)；過(guò)分干燥又會(huì)導(dǎo)致磁珠開(kāi)裂進(jìn)而降低純化得率。通常情況下，室溫干燥3-5 min足以讓磁珠充分干燥。

3.cDNA質(zhì)控&文庫(kù)質(zhì)控

1）通常情況下，構(gòu)建好的全長(zhǎng)cDNA&文庫(kù)可通過(guò)長(zhǎng)度分布檢測(cè)和濃度檢測(cè)來(lái)進(jìn)行質(zhì)量評(píng)價(jià)。

2）文庫(kù)濃度檢測(cè)可使用：基于雙鏈DNA熒光染料的方法，如Qubit®、PicoGreen®等；基于qPCR絕對(duì)定量的方法。

3）文庫(kù)濃度檢測(cè)不可使用：基于光譜檢測(cè)的方法，如NanoDrop®等。

4）文庫(kù)長(zhǎng)度分布檢測(cè)，可通過(guò)Agilent Bioanalyzer 2100等基于毛細(xì)管電泳或微控流原理的設(shè)備進(jìn)行檢測(cè)。

4.自備材料 (Other Material)

1. 膠珠：翌圣Cat#12526或其他等效產(chǎn)品。
2. Oil、破油試劑：YeaCell^TM Recovery Agent (Cat#12525)或10×Genomics芯片上帶的試劑及其他等效產(chǎn)品。
3. 芯片：10×Genomics，Chromium Next GEM Chip G Single Cell Kit及其他等效芯片。
4. Index：翌圣，YeaCell^TM UDI Primer kit for Illumina® (Cat#12522)及其他等效產(chǎn)品。
5. 儀器：10×Genomics，Chromium Controller及其他等效微流控設(shè)備。
6. 擴(kuò)增產(chǎn)物質(zhì)檢：Agilent Bioanalyzer 2100、Qsep100（Bioptic）。
7. Qubit定量試劑及儀器：1×dsDNA HS Assay Kit (Yeasen Cat#12642)及其他等效產(chǎn)品。
8. 其他材料：無(wú)水乙醇、滅菌超純水； 200 μL低吸附PCR管、200 μL低吸附槍頭、磁力架。

 

使用方法

 

1.乳濁液破油純化

以YeaCell^TMSingle Cell 3? RNA-seq Kit（Yeasen Cat#12520）為例，獲得的油包水乳濁液（GEM）逆轉(zhuǎn)錄后需進(jìn)行下述操作。

1）加入125 μL Recovery Agent（Yeasen Cat#12525或其他等效產(chǎn)品）到樣品孔中，不要吹打或者震蕩，靜置5min后吸棄125 μL下層油相。

注：Recovery Agent與Reducing Agent名稱相近，但是用處相差較大，需要注意不能弄混淆。

2)參照表1準(zhǔn)備Dynabeads Cleanup Mix（提前將Dynabeads MyOne SILANE磁珠由冰箱中取出，室溫平衡至少30 min，配制80%乙醇）。

表1 Dynabeads Cleanup Mix配制

名稱	體積 (μL)
Cleanup Buffer	182
Dynabeads MyOne SILANE	8
Reducing Agent	5
Nuclease-free Water	5
Total	200

3）Dynabeads Cleanup Mix渦旋混勻后加入到上述GEM樣品中，槍頭吹打10次。

4）室溫孵育10min，間隔5min用槍頭吹打混勻。

5）參照表2準(zhǔn)備Elution Solution I，渦旋混勻后瞬時(shí)離心。

 

表2 Elution Solution I配制

名稱	體積 (μL)
Buffer EB	49
10% Tween20	0.5
Reducing Agent	0.5
Total	50

6）孵育10min結(jié)束后，置于磁力架上，待液體完全澄清后吸棄上清。

7）保持PCR管始終置于磁力架中，加入200 μL新鮮配制的80%乙醇漂洗磁珠，室溫孵育30 sec后，小心移除上清。

8）重復(fù)步驟7一次。

9）保持PCR管始終置于磁力架中，開(kāi)蓋空氣干燥磁珠（1 min）。

10）將PCR管從磁力架中取出，加入35.5 μL Elution Solution I，渦旋振蕩或使用移液器輕輕吹打至充分混勻。

11）室溫靜置5 min后，將PCR管短暫離心并置于磁力架中靜置，待溶液澄清后（約3 min），小心移取35 μL上清至新PCR管中。

12）銜接YeaCell^TM Single Cell 3? RNA-seq Kit(Yeasen Cat#12520或其他等效產(chǎn)品)cDNA擴(kuò)增步驟。

2.cDNA純化

以YeaCell^TM Single Cell 3? RNA-seq Kit（Yeasen Cat#12520）為例，cDNA擴(kuò)增結(jié)束后，使用cDNA Clean Beads純化回收cDNA。

1）準(zhǔn)備工作：將cDNA Clean Beads由冰箱中取出，室溫平衡至少30 min。配制80%乙醇。

2）渦旋振蕩或上下顛倒磁珠以保證充分混勻。

3）吸取60 μL cDNA Clean Beads（0.6×，Beads:cDNA=0.6:1）至cDNA產(chǎn)物中，吹打混勻，室溫孵育5 min。

4）將PCR管短暫離心并置于磁力架中分離磁珠和液體，待溶液澄清后（約5 min），小心移除上清。

5）保持PCR管始終置于磁力架中，加入200 μL新鮮配制的80%乙醇漂洗磁珠，室溫孵育30 sec后，小心移除上清。

6）重復(fù)步驟5）一次。

7）保持PCR管始終置于磁力架中，開(kāi)蓋空氣干燥磁珠至剛剛出現(xiàn)龜裂（1 min）。

8）將PCR管從磁力架中取出，加入40.5 μL Buffer EB，輕輕吹打至充分混勻，室溫靜置5 min。將PCR管短暫離心并置于磁力架中靜置，待溶液澄清后（約3 min），小心移取40 μL上清至新PCR管中。

9）使用Qubit對(duì)文庫(kù)進(jìn)行定量。4℃保存72 hour，－20℃保存一周或者立即進(jìn)行下一步文庫(kù)構(gòu)建。

3.DNA 純化

參照YeaCell^TM Single Cell 3? RNA-seq Kit（Yeasen Cat#12520）說(shuō)明書(shū)，使用DNA Clean Beads對(duì)構(gòu)建好的文庫(kù)進(jìn)行純化或分選操作。

4. cDNA&文庫(kù)質(zhì)控

1）cDNA純化后獲得的產(chǎn)物，可通過(guò)Agilent Bioanalyzer 2100的High Sensitivity DNA Chip檢測(cè)cDNA擴(kuò)增產(chǎn)物。

2）構(gòu)建好的文庫(kù)純化或者分選后獲得的產(chǎn)物，可以通過(guò)濃度檢測(cè)和長(zhǎng)度分布檢測(cè)來(lái)進(jìn)行質(zhì)量評(píng)價(jià)。

 

 

 

Ver.CN20250207