產(chǎn)品說明書
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已發(fā)表文獻
產(chǎn)品簡介
Hieff® Superfast DNA Methylation Bisulfite Kit超快速DNA亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化試劑盒（柱式）可以快速地將DNA樣品中的未甲基化胞嘧啶轉(zhuǎn)化成尿嘧啶而甲基化胞嘧啶維持不變，雙鏈DNA經(jīng)過高溫亞硫酸氫鹽處理后，雙鏈DNA解鏈變成單鏈，在HSO3-作用下，導致胞嘧啶殘基發(fā)生脫氨基反應并將它們轉(zhuǎn)化為尿嘧啶，甲基化修飾的殘基保持不變。進而在后續(xù)PCR擴增過程中，尿嘧啶會被胸腺嘧啶(T)取代。轉(zhuǎn)化反應時間僅需5 min；DNA投入量范圍100 pg-2 μg; 未甲基化的胞嘧啶轉(zhuǎn)化效率≥99%。轉(zhuǎn)化后的產(chǎn)物適用于PCR擴增和NGS測序等下游應用。
產(chǎn)品信息
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貨號 |
12225ES10/12225ES50 |
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規(guī)格 |
10T/50T |
組分信息
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組分編號 |
組分名稱 |
12225ES10 |
12225ES50 |
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12225-A |
轉(zhuǎn)化液 |
2 mL/瓶×1 |
3.3 mL/瓶×3 |
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12225-B |
洗滌液 |
1.1 mL/瓶×1 |
5.5 mL/瓶×1 |
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12225-C |
脫硫液 |
2.2 mL/瓶×1 |
11 mL/瓶×1 |
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12225-D |
洗脫液 |
500 μL/管×1 |
1.5 mL管×1 |
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12225-E |
純化柱 |
10個 |
50個 |
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12225-F |
收集管 |
10個 |
50個 |
注：10T/盒：向洗滌液中加入4.4 mL的無水乙醇；
50T/盒：向洗滌液中加入22 mL的無水乙醇；
加入無水乙醇后，顛倒混勻后備用，此時應將瓶蓋擰緊，防止乙醇揮發(fā)影響試劑使用效果。
儲存條件
12225-A轉(zhuǎn)化液室溫避光保存，其他組分室溫保存，有效期12個月。
注意事項
- 為保證下游實驗的順利進行，進行轉(zhuǎn)化步驟時，應對投入的DNA總量進行精確定量，推薦使用Qubit3.0/4.0對投入DNA進行定量，且A260 / A280比值在1.7 - 1.9之間；
- DNA投入量范圍100 pg-2 μg，最佳投入量為100 ng - 1 μg，過低不利于下游檢測，過高可能導致回收率/轉(zhuǎn)化效率降低。
- 轉(zhuǎn)化液/脫硫液/洗滌液中含有揮發(fā)性組分，使用完畢后，應及時擰緊瓶蓋，室溫儲存。
- 轉(zhuǎn)化后樣本，應及時進行下游實驗，若短暫儲存，可置于-20℃，長期儲存可置于-80℃。
- 為了您的安全和健康，請穿實驗服并佩戴一次性手套操作。
- 本產(chǎn)品僅作科研用途！
使用說明
試劑及耗材準備：1.5 mL的無菌離心管，無菌槍頭，無核酶水，無水乙醇，PCR管；
- 亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化：
- 根據(jù)需要實驗的樣本數(shù)量，準備相應的無菌PCR管，并按照下表要求配制反應體系：
- 轉(zhuǎn)化體系
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組分 |
體積 |
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投入DNA |
100 pg-2 μg |
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轉(zhuǎn)化液 |
180 μL |
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ddH2O |
Up to 150 μL |
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總體積 |
200 μL |
用移液器將上述體系吹打混勻或短暫渦旋混勻5 s，短暫離心，將反應液離心至PCR管底部。
- 注意：1. 此時PCR管中反應液總體積為200 μL，為使轉(zhuǎn)化更充分，應在步驟2）吹打混勻后，將反應液等分，轉(zhuǎn)移至新的無菌PCR管中，運行轉(zhuǎn)化程序。轉(zhuǎn)化結(jié)束后，將兩個PCR管中的反應液合并至同一個純化柱中進行純化。
- 如果樣本體積在 20-40 μL 之間，則減少轉(zhuǎn)化液的體積，總體積保持200 μL。
- 如果樣本體積為50 μL，則轉(zhuǎn)化液加入150 μL，總體積保持200 μL，轉(zhuǎn)化時間延長至6 min以上。
3）CT轉(zhuǎn)化程序設置
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溫度 |
時間 |
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98 ℃ |
5 min |
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4 ℃ |
∞ |
將PCR管置于預設好程序的PCR儀上，進行上述反應。
- 轉(zhuǎn)化產(chǎn)物純化
- 準備好相應樣本個數(shù)的純化柱套件，將200 μL的轉(zhuǎn)化后的反應液轉(zhuǎn)移至純化柱中，13000 g離心30-60 s，丟棄濾液，將純化柱重新放于收集管中；
- 向純化柱中加入100 μL的洗滌液（確認已經(jīng)添加無水乙醇），13000 g離心30-60s，丟棄濾液，將純化柱重新放于收集管中；
- 向純化柱中加入200 μL的脫硫液，于室溫中靜置反應20 min，反應結(jié)束后13000 g離心30-60 s，丟棄濾液，將純化柱重新放于收集管中；
- 向純化柱中加入200 μL的洗滌液，13000 g離心30-60s，丟棄濾液，將純化柱重新放于收集管中；
- 重復步驟4）一次；
- 將純化柱轉(zhuǎn)移至準備好的1.5 mL的離心管中，開蓋晾干后，加入10-30 μL的洗脫液至濾膜中央，室溫靜置1min后，13000 g離心1 min，收集洗脫液；
- 將洗脫后的樣本置于-20 ℃暫存，若長期保存，請將樣本置于-80 ℃保存，同時應避免不必要的反復凍融。
注：純化后轉(zhuǎn)化產(chǎn)物可直接用于后續(xù)PCR反應或測序流程。
Ver.CN20240222
