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D-Luciferin,Sodium Salt D-熒光素鈉鹽

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已發(fā)表文獻

產(chǎn)品描述

D-熒光素（D-Luciferin）是熒光素酶（Luciferase）的常用底物，普遍用于整個生物技術(shù)領(lǐng)域，特別是體內(nèi)活體成像技術(shù)。其作用機制是在ATP和熒光素酶的作用下，熒光素（底物）能夠被氧化發(fā)光。當熒光素過量時，產(chǎn)生的光量子數(shù)與熒光素酶的濃度呈正相關(guān)性（見下圖）。將攜帶熒光素酶編碼基因（Luc）的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入細胞后，導入研究動物如大小鼠體內(nèi)，之后注入熒光素，通過生物發(fā)光成像技術(shù)（BLI）來檢測光強度變化，從而實時監(jiān)測疾病發(fā)展狀態(tài)或藥物的治療功效等。也可以利用ATP對此反應(yīng)體系的影響，根據(jù)生物發(fā)光強度的變化來指示能量或生命體征。

D-熒光素也常用于體外研究，包括熒光素酶和ATP水平分析；報告基因分析；高通量測序和各種污染檢測。目前市場上有三種產(chǎn)品形式，D-熒光素（游離酸），D-熒光素鈉鹽，以及D-熒光素鉀鹽。這三種產(chǎn)品主要的差別在于溶解特性上。D-熒光素（游離酸）水溶性以及緩沖體系的溶解性都很弱，除非溶于弱堿如NaOH和KOH溶液。溶于甲醇（10 mg/ml）和DMSO（50 mg/ml）。但鈉鹽和鉀鹽形式的D-熒光素能夠非常容易且快速的溶入水或者緩沖液中，使用方便，溶劑無毒性，特別適合體內(nèi)實驗。配成液體后的這三種產(chǎn)品，在絕大多數(shù)的應(yīng)用上都沒有實質(zhì)性的差別。

產(chǎn)品性質(zhì)

中文別名（Chinese synonym）	D-熒光素鈉鹽；
英文別名（English synonym）	(S)-4,5-Dihydro-2-(6-hydroxy-2-benzothiazolyl)-4-thiazolecarboxylic acid sodium salt; D-Luciferin firefly, sodium salt monohydrate;
CAS號（CAS NO.）	103404-75-7
分子式（Formula）	NaC₁₁H₇N₂O₃S₂· H₂O
分子量（Molecular weight）	302.3 g/mol
外觀（Appearance）	淡黃色粉末
溶解性（Solubility）	溶于水（高達100 mg/ml）
純度（Purity）（HPLC）	≥95.0%

運輸和保存方法

室溫運輸。-20℃干燥避光保存，有效期2年。

使用方法

1．體外生物發(fā)光檢測
1）用蒸餾水溶解D-熒光素鈉鹽，配制成30mg/ml的儲存液（200×）。混勻后立即使用或分裝于-20℃或-80℃凍存，避免反復凍融。
2）用預熱好的組織培養(yǎng)基1:200稀釋儲存液，配制工作液（終濃度150µg/ml）。
3）去除培養(yǎng)細胞的培養(yǎng)基。
4）待圖像分析前，向細胞內(nèi)添加1×熒光素工作液，然后進行圖像分析。

2． 活體成像分析
1）用無菌的PBS（w/o Mg²⁺）或者DPBS（w/o Mg²⁺）配制D-熒光素鈉鹽工作液（15mg/ml），0.2µm濾膜過濾除菌?；靹蚝罅⒓词褂没蚍盅b于-20℃或-80℃凍存，避免反復凍融。一旦使用，放到4℃解凍，保持冰冷且避光。

2）注射量取決于注射方式，具體如下：

注射方式	劑量
靜脈注射（25-27gauge針頭）	按10µl/g體重濃度，加入相應(yīng)體積的15mg/ml熒光素工作液
腹腔注射（25-27gauge針頭）	按10µl /g體重濃度，加入相應(yīng)體積的15mg/ml熒光素工作液
肌肉注射（27gauge針頭）	50µl，濃度為1-2mg/ml熒光素工作液
鼻內(nèi)注射（pipette）	50µl，濃度為3mg/ml熒光素工作液

3）注射入體內(nèi)10-20 min（待光信號達到最強穩(wěn)定平臺期），再進行成像分析。

注：建議對每只動物模型都需要建立熒光素酶動力學曲線，從而確定最高信號檢測時間和信號平臺期。

注意事項

1) 本品（firefly luciferin）和甲蟲熒光素（beetle luciferin）都是指化合物(S)-2-(6-Hydroxy-2-benzothiazolyl) -2-thiazoline-4-carboxylic acid，僅僅是不同公司在命名上的差異。
2) 本品保存和操作的過程中都要避光。另外水溶性儲存液過濾除菌后，可以-20℃或-80℃分裝凍存，避免反復凍融。
3) 注射方式，動物類型以及體重等都會影響信號的發(fā)射，因此建議每次實驗都要做熒光素酶動力學曲線，確定最佳信號平臺期和最佳的檢測時間。
4) 為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。

HB220915

Q：熒光蟲熒光素（ Firefly Luciferin）、甲蟲熒光素（ Beetle Luciferin）和 D-Luciferin 有區(qū)別嗎？

A：無區(qū)別。三者僅僅是不同公司在命名上的差異，均是化合物 (S)-2-(6-Hydroxy-2-benzothiazolyl)-2

-thiazoline-4-carboxylic acid。

Q：該系列產(chǎn)品主要用于哪些應(yīng)用？

A：除用于活體成像外，熒光素類產(chǎn)品還用于熒光素酶參與的其他應(yīng)用中，如體外報告基因檢測、微生物/病毒監(jiān)測、焦磷酸測序等

Q：熒光素鈉鹽和 D-熒光素鈉鹽的區(qū)別？

A：熒光素鈉鹽：可用于細胞通透性檢測，通過檢測 OD490 處吸光度值測定顏料的通透性。 D-

熒光素鈉鹽：用于活體成像和報告基因系統(tǒng)，通過冷發(fā)光模塊檢測，不需要激發(fā)光激發(fā)。

Q：熒光素鉀鹽、鈉鹽、自由酸區(qū)別？

A：三者的區(qū)別主要在于： 1）溶解性：鹽形式易溶于水，其中鉀鹽溶解度為 60mg/ml，鈉鹽溶解度為 100mg/ml。自由酸不易溶于水，可用碳酸氫鈉溶液弱堿調(diào)節(jié)溶解，其在甲醇中的溶解度為10mg/ml，DMSO 中溶解度為 50mg/ml。 2）毒性方面：鹽形式在使用過程中較方便，尤其是在體內(nèi)成像實驗中，因其能夠溶解在水中，反應(yīng)毒性也會更小些（熒光素是一種由苯丙噻唑和噻唑羧酸基團組成的低分子量有機化合物，有低毒性）。3）使用效果：無明顯差異。在體內(nèi)實驗研究中，選用鉀鹽使用率較高。

Q：熒光素的純度對實驗有成影響嗎？

A：有影響。99%以上的純度較好。對于 99%純度的熒光素，有 1%的固體雜質(zhì)。若是這 1 g 的雜質(zhì)溶解在25ml 的緩沖液中（該稀釋比例是進行活體成像實驗的標準稀釋方法），此時雜質(zhì)的濃度為 0.4 g/L。假設(shè)雜質(zhì)的分子量為 1000 g/mol,那么雜質(zhì)的物質(zhì)的量濃度為 400 μM，該濃度可能會抑制細胞內(nèi)某些酶的作用，并且有可能降低實驗效果或?qū)游锂a(chǎn)生傷害。

Q：產(chǎn)品穩(wěn)定性如何？

A：粉末避光保存于-20 或-70℃，有效期至少 1 年。

Q：活體成像底物作用原理？

A：D-熒光素（D-Luciferin）是熒光素酶（Luciferase）的常用底物。其作用機制是在 ATP 和熒光素酶的作用下，熒光素（底物）能夠被氧化發(fā)光。當熒光素過量時，產(chǎn)生的光量子數(shù)與熒光素酶的濃度呈正相關(guān)性。2、天然腔腸素（Coelenterazine native）是海腎熒光素酶（Rluc）和 Gaussia 熒光素酶（Gluc）等多種熒光素酶的作用底物。

Q：推薦儀器？多功能酶標儀能用嗎？

A：推薦儀器：1、具有生物化學發(fā)光檢測模塊。熒光素產(chǎn)生的光可以被光度計或閃爍計數(shù)器檢測。常見的活體成像儀器：如 IVIS® Lumina 小動物活體成像系統(tǒng)，德國 Bruker 公司的 In-Vivo Xtreme 多模式小動物活體成像儀。2、多功能酶標儀：需要和儀器廠家確認是否具體生物化學發(fā)光檢測模塊（注：不能用熒光顯微鏡。）

Q：底物的激發(fā)波長和發(fā)射波長？

A：化學發(fā)光，無需激發(fā)波長。螢火蟲熒光素發(fā)射波長是 560nm。海腎熒光素發(fā)射波長是 465 nm。

Q：底物可以進入活細胞中嗎？

A：可以通過血腦屏障，胎盤屏障和血液測試屏障，也可以進入活細胞。

Q：熒光素類注射方式和用量？

A：下面建議濃度來源于文獻：1）注射方式：可通過腹腔注射或尾靜脈注射 2）注射量：科學的方法是根據(jù)動力學曲線評估注射劑量。建立最初嘗試注射劑量為：150mg 底物/kg 小鼠體重。因此，購買量可按照上述方法計算：若 10 只小鼠，22 -25g，則需要底物 33 -37.5mg 。

Q：熒光素的發(fā)光特性如何？

A：熒光素腹腔注射老鼠后約 3 min 后，能夠表達熒光素酶的細胞開始發(fā)光，10 min 后強度達到穩(wěn)定的最高點，在最高點持續(xù)約 10 - 15 min 后開始衰減，可在注射后 10 -15 min 內(nèi)檢測。僅供參考，建議預實驗建立熒光素酶動力學曲線，從而確定最高信號檢測時間和信號平臺期

Q：活體成像實驗，無效果的原因？

A：成功進行活體成像實驗需要以下條件：目的組織或細胞表達熒光素酶基因；熒光素底物注射成功；依賴于發(fā)光部位的組織厚度。若實驗不成功，可從上述因素查找，熒光素酶基因是否表達，熒光素底物是否未正確注射，及發(fā)光部位較深等

Q：熒光素鉀（鈉）鹽溶液如何配制？必須用不含鈣離子和鎂離子的 DPBS 溶解嗎？

A：1、下面建議濃度來源于文獻：

1）儲備液（體外實驗用）濃度 100mM，約相當于 30mg/mL。用無菌蒸餾水溶解。建議：現(xiàn)配現(xiàn)用，若無條件，可分裝保存。長期保存可能會導致信號衰減。

2）1×工作液（體外實驗用）濃度 0.5mM，約相當于 150ug/mL。用預熱的培養(yǎng)基稀釋儲存液至 1×。建議：現(xiàn)配現(xiàn)用，若多余，則舍棄。不建議再次使用。

3）15mg/mL 儲存液（動物實驗用）不含鈣離子和鎂離子的 DPBS 溶解（因為一方面，鈣鎂離子通常對胰酶活性有影響；另外一方面在活體成像實驗時，Mg2+是催化熒光素底物氧化的重要因素，而Ca2+是和腔腸素底物氧化有關(guān)的離子），混勻。0.22μM 濾器過濾除菌。建議：現(xiàn)配現(xiàn)用，長期保存可能會導致信號衰減。

除了 DPBS 外，還可以用其他緩沖液溶解熒光素底物，如生理鹽水 Nacl 等。原則上避免溶液中的陽離子對實驗造成影響。可參考相關(guān)文獻操作。

Q：D-熒光素鈉鹽，對動物有毒副作用嗎？

A：一般情況下，D-熒光素鈉鹽不會對動物產(chǎn)生毒副作用。

Q：熒光素鈉鹽，分解率是多少？

A：沒有該信息。

Q: 為啥11401試劑盒里要裂解細胞，40901這個單獨的底物不需要啊？

A: 1、熒光素酶是表達在細胞內(nèi)，是一種不存在于人類物種的水解酶（所以本底很低），它不能透膜。熒光素酶的底物是環(huán)狀小分子，是疏水的，因而可以透膜的，因此只要存在熒光素酶表達，那必然是外源的，那么將底物加到細胞培養(yǎng)基中或打到體內(nèi)均能得到信號。

2、報告基因體外檢測需要細胞裂解是為了避免細胞轉(zhuǎn)染異質(zhì)性、底物滲透不均勻和信號不均一而強行勻質(zhì)化的做法。體外報告基因檢測是一個定量且靈敏度很高的實驗，報告基因檢測需要ATP和氧氣的存在，裂解細胞是需要把表達的熒光素酶完全釋放出來，能夠有更好的反應(yīng)，因為細胞內(nèi)的氧氣含量有限，如果不裂解，會導致信號一定程度的降低（有的裂解液也做了一些優(yōu)化，比如額外加了ATP以提高信號等）。因此報告基因體外檢測裂解細胞能夠有更好的信號；

3、活體成像，檢測儀器功率大，能夠透過皮膚，細胞，有更強的穿透力，因此可以不用裂解細胞就可以檢測到很強的熒光信號，另外活體成像檢測相對比較粗糙。

Q：體外檢測細胞時熒光素加入的工作液體積是多少？檢測儀器使用什么？

A：對于96孔板，細胞數(shù)量104-106個細胞/孔，工作液體積加入100ul，工作濃度為：0.15mg/ml;推薦使用酶標儀（具生物化學發(fā)光檢測模塊）進行檢測。

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