產(chǎn)品說明書
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已發(fā)表文獻(xiàn)
產(chǎn)品描述
真核生物中mRNA經(jīng)轉(zhuǎn)錄后修飾在5'端形成一個特殊結(jié)構(gòu)，即帽子結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)對mRNA的穩(wěn)定、轉(zhuǎn)運與翻譯過程均有較重要作用。牛痘病毒加帽酶是催化形成帽子結(jié)構(gòu)的有效酶，其由D1和D12兩個亞基組成，兼具RNA三磷酸酯酶活性、鳥苷酰基轉(zhuǎn)移酶活性和鳥嘌呤甲基轉(zhuǎn)移酶活性，可將7-甲基鳥嘌呤帽結(jié)構(gòu)（m7Gppp）連接到RNA的5'末端（m7Gppp5'N）。牛痘病毒加帽酶，在合適濃度的加帽緩沖液（Capping buffer），鳥苷三磷酸（GTP），S-腺苷甲硫氨酸（SAM）等存在條件下，能夠在一個小時之內(nèi)對RNA進行加帽，并且保證正確的方向。
本品以無菌液體形式提供，可應(yīng)用于體內(nèi)/體外翻譯前mRNA的加帽反應(yīng)或mRNA的5'末端標(biāo)記反應(yīng)。
產(chǎn)品性質(zhì)
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來源（Source） |
攜帶牛痘病毒加帽酶基因的E. coli |
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最適溫度（Optimum Temperature） |
37℃ |
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儲存緩沖液（Storage Buffer） |
20mM Tris-HCl pH 8.0，100 mM NaCl，1 mM DTT，0.1 mM EDTA，0.1% Triton X-100，50%甘油 |
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活性單位定義（Unit Definition） |
37℃條件下，1小時內(nèi)將10 pmol GTP（α- 32P）摻入到一條含80個核苷酸（80nt）轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物上所需要的酶量，即為1個單位。 |
產(chǎn)品組分
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組分編號 |
組分名稱 |
產(chǎn)品編號/規(guī)格 |
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10615ES76 （500 U） |
10615ES84 （2000 U） |
10615ES92 （10000 U） |
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10615-A |
10×Capping Buffer |
150 μL |
500 μL |
1.25 mL×2 |
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10615-B |
Vaccinia Capping Enzyme（10 U/μL） |
50 μL |
200 μL |
1 mL |
運輸和保存方法
干冰運輸。 -15℃ ~ -25℃保存，有效期一年。推薦分裝保存，避免反復(fù)凍融。
使用方法
加帽反應(yīng)（反應(yīng)體系20 μL）
本步驟適用于10μg RNA（≥ 100 nt）的加帽反應(yīng)，且可根據(jù)實驗需要放大。
1. 取10μg RNA至1.5 mL離心管，使用無核酸酶的水稀釋至9.5 μL；
2. 65℃加熱5 min；
3. 取出離心管置于冰上5 min；
4. 依次加入以下組分：
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組分 |
體積 |
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Denatured RNA |
9.5 μL |
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10×Capping Buffer |
2.0 μL |
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Murine RNase inhibitor(40 U/μL) |
0.5 μL |
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GTP (10 mM) |
1.0 μL |
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SAM (10 mM, fresh) |
1.0 μL |
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Vaccinia Capping Enzyme (10 U/μL) |
5.0 μL |
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Cap 2´-O-Methyltransferase (50 U/μL) |
1.0 μL |
【注】：10×Capping Buffer(Cat# 10666)：0.5 M Tris-HCl, 50 mM KCl, 10 mM MgCl2, 10 mM DTT pH 8.0 @ 25°C。
5. 37°C孵育2 h；
6. RNA加帽完成，可進行后續(xù)實驗。
注意事項
1. 為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作；
2. 所提取的RNA需經(jīng)過純化并使用無核酸酶的水重懸；
3. 在加入酶之前需要對RNA溶液進行加熱以去除5'末端的二級結(jié)構(gòu)；
4. 對于已知5'末端結(jié)構(gòu)的RNA，可以延長反應(yīng)時間至4 h，提高加帽效率；
5. 5'末端標(biāo)記反應(yīng)體系中，GTP儲液應(yīng)稀釋為反應(yīng)體系中mRNA摩爾濃度的1-3倍。
HB220701
