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DNA-蛋白質(zhì)互作研究解決方案(上)

基因的表達調(diào)控影響生物體的功能變化。其分為轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控、轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控、翻譯水平調(diào)控以及翻譯后水平調(diào)控。而基因的表達調(diào)控受多方面的影響，其中一種就是DNA-蛋白質(zhì)互作的影響?？茖W家們發(fā)現(xiàn)，DNA不僅可以編碼蛋白質(zhì)，還可以和蛋白質(zhì)結(jié)合，調(diào)節(jié)基因活性，同時通過影響RNA轉(zhuǎn)錄來影響基因的表達；此外，DNA還可以作為各種化學修飾物的底物，對基因的沉默發(fā)揮一定的作用。蛋白質(zhì)-DNA互作參與了很多體內(nèi)的生物學過程，弄清DNA-蛋白質(zhì)相互作用的機制，對于我們了解DNA轉(zhuǎn)錄調(diào)控和基因表達機制，揭示各種生命活動現(xiàn)象具有極其重要的指導作用。

DNA-蛋白質(zhì)互作研究中，根據(jù)已知什么、未知什么，分為未知DNA與未知蛋白質(zhì)互作研究、已知蛋白質(zhì)與未知DNA互作研究和已知DNA序列與未知蛋白質(zhì)互作研究。

下面我們來一一揭曉。

未知DNA與未知蛋白質(zhì)研究

研究DNA與蛋白質(zhì)互作時，通常需要有目標DNA或者目標蛋白質(zhì)。如果研究時，只有處理材料，需要找尋處理材料中影響材料表型變化的調(diào)控因子，可以進行ATAC-seq實驗。

技術(shù)介紹

ATAC-seq全稱Assay for Transposase Accessible Chromatin with high-throughput sequencing，即利用轉(zhuǎn)座酶研究染色質(zhì)可進入性的高通量測序技術(shù)。主要是對生物樣本進行提核處理，之后利用Tn5轉(zhuǎn)座酶入核，對染色質(zhì)進行空間構(gòu)象切割，將染色質(zhì)的開放區(qū)域DNA切割后富集純化，最后對獲得的DNA進行建庫測序并分析預測開放區(qū)域中的轉(zhuǎn)錄因子及其結(jié)合的DNA序列（motif）。

實驗步驟

性能展示

圖.100-10w細胞投入量ATAC結(jié)果

細胞投入量從100個到10萬個，均能得到建庫結(jié)果，且結(jié)果的擬合度較高。

產(chǎn)品推薦

產(chǎn)品名稱

貨號

規(guī)格

Hieff NGS®

ATAC-Seq Library Prep Kit for Illumina®

ATAC建庫試劑盒

12208ES12/48

12 T/ 48 T

Hieff NGS® Tagment Index Kit for Illumina®

Tn5測序接頭

12416ES24/96

48 T/ 192 T

已知蛋白質(zhì)，研究與未知DNA互作

已知材料中研究蛋白質(zhì)，需要探究該目的蛋白質(zhì)靶向的DNA結(jié)合區(qū)域，可以使用ChIP-seq、CUT&Tag、DAP-seq、CUT&RUN進行研究得到結(jié)合的DNA序列后，再利用EMSA、雙熒光素酶報告基因、酵母單雜交實驗、DNase I足跡試驗等。若是研究時，發(fā)現(xiàn)可能出現(xiàn)共調(diào)控的區(qū)域，還需要進行CoIP或者GST pull down實驗進行驗證。

ChIP-seq、CUT&Tag、DAP-seq、CUT&RUN介紹

技術(shù)介紹

ChIP

ChIP是研究DNA與蛋白互作的傳統(tǒng)經(jīng)典方法，需要將樣本進行甲醛交聯(lián)后再用超聲設(shè)備進行片段化處理，之后利用特異性抗體進行靶向富集，將富集得到的DNA進行建庫測序分析即得到靶向蛋白質(zhì)互作的DNA信息。

CUT&Tag

CUT&Tag是研究DNA與蛋白互作的新型技術(shù)，利用轉(zhuǎn)座酶對抗體靶向區(qū)域進行切割，將切割得到的DNA序列可以一步擴增得到DNA文庫。相對于ChIP-seq實驗，CUT&tag具有可重復性強、背景噪音低、起始量要求低等優(yōu)點。

Multi-CUT&Tag

Multi-CUT&Tag是利用新興的納米抗體偶聯(lián)Tn5（Nanobody-Tn5），利用納米抗體識別一抗，使得Tn5被納米抗體靶向到特定位置發(fā)揮靶向切割，將切割得到的DNA序列進一步擴增得到DNA文庫。相對于傳統(tǒng)CUT&Tag技術(shù)，Multi-CUT&Tag可以實現(xiàn)一份樣本，同時研究兩種靶標，節(jié)約樣本和時間，實驗無需二抗，減少實驗流程。

CUT&RUN

CUT&RUN是研究DNA與蛋白質(zhì)互作的新型技術(shù)，利用Mnase酶對染色質(zhì)開放區(qū)域進行切割，之后將切割得到的DNA進行建庫以獲得靶向蛋白質(zhì)互作的DNA信息。

DAP-seq

DAP-seq是研究DNA與蛋白互作的技術(shù)，它屬于體外ChIP-seq，主要針對一些非模式物種構(gòu)建轉(zhuǎn)基因體系或者過表達實驗不容易操作的樣本，本實驗的優(yōu)點是無需購買抗體即可實驗。

CUT&Tag	Multi-CUT&Tag	ChIP-seq	CUT&RUN	DAP-seq
胞內(nèi)反應(yīng)	胞內(nèi)反應(yīng)	*胞內(nèi)反應(yīng)	胞內(nèi)反應(yīng)	胞外反應(yīng)
收集細胞，無需特殊處理	收集細胞，無需特殊處理	甲醛交聯(lián)	收集細胞，無需特殊處理	提取樣本DNA進行片段化和接頭連接
ConA磁珠與細胞孵育	ConA磁珠與細胞孵育	細胞破碎裂解，超聲打斷gDNA	ConA磁珠與細胞孵育
一抗二抗結(jié)合目的蛋白	兩種抗體同時孵育并靶向（無需二抗）	一抗結(jié)合目的蛋白	一抗二抗結(jié)合目的蛋白	麥胚乳蛋白表達系統(tǒng)表達蛋白并在在體外與DNA進行共孵育
轉(zhuǎn)座酶復合體結(jié)合二抗，激活反應(yīng)	轉(zhuǎn)座酶結(jié)合、激活反應(yīng)	免疫沉淀	MNase酶復合體結(jié)合二抗，激活反應(yīng)
磁珠回收DNA片段	磁珠回收DNA片段	洗脫，解交聯(lián)，獲得DNA片段	純化獲得DNA片段	洗脫并純化獲得DNA片段
一步法PCR擴增文庫	一步法PCR擴增文庫	多步反應(yīng)：修復加A，加接頭，PCR擴增	多步反應(yīng)：修復加A，加接頭，PCR擴增	多步反應(yīng)：修復加A，加接頭，PCR擴增
產(chǎn)物純化，上機測序	產(chǎn)物純化，上機測序	產(chǎn)物純化，上機測序	產(chǎn)物純化，上機測序	產(chǎn)物純化，上機測序
總時長：7.5 hour	總時長：6 hour	總時長：3-5 Day	總時長：1-2 Day	總時長：1-2 Day

實驗步驟

性能展示

圖.不同組蛋白修飾的CUT&Tag及Multi-CUT&Tag實驗結(jié)果

Multi-CUT&Tag可以實現(xiàn)一份樣本，兩種不同組蛋白修飾的研究。組蛋白修飾同時研究的數(shù)據(jù)拆分后的結(jié)果與常規(guī)單靶標研究結(jié)果一致。

產(chǎn)品推薦

產(chǎn)品名稱	貨號	規(guī)格
Hieff NGS® G-Type In-Situ DNA Binding Profiling Library Prep Kit for Illumina® CUT&Tag建庫試劑盒（pA/G-Tn5款）	12598ES12/48	12 T/ 48 T
Hieff NGS® Multi-CUT&Tag Library Prep Kit for Illumina®Multi-CUT&Tag試劑盒（Nanobody-Tn5款）	12592ES12/48	12 T/ 48 T
Hieff NGS® Tagment Index Kit for Illumina® Tn5測序接頭	12416ES24/96	48 T/ 192 T
Hieff NGS® OnePot Pro DNA Library Prep Kit V2 CUT&RUN或者ChIP-seq后續(xù)DNA建庫	12195ES24/96	24 T/ 96 T
Hieff NGS® 384 CDI Primer for Illumina®	12413ES02	96×2T

欲知后續(xù)內(nèi)容，請待下周揭曉……

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