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Ceturegel?基質(zhì)膠應(yīng)用——小鼠小腸類(lèi)器官構(gòu)建

類(lèi)器官（organoids）是指利用干細(xì)胞、祖細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞等在體外培養(yǎng)出的3D細(xì)胞培養(yǎng)物并具有一定的空間結(jié)構(gòu)組織類(lèi)似物。2021年，類(lèi)器官技術(shù)被列為“十四五”國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)專(zhuān)項(xiàng)[1]，作為疾病模型，相比于傳統(tǒng)2D疾病模型，類(lèi)器官在闡明疾病的發(fā)展、穩(wěn)態(tài)性和發(fā)病機(jī)理等與體內(nèi)環(huán)境更加接近，在多領(lǐng)域?qū)l(fā)揮重要，諸如細(xì)胞治療、藥物研發(fā)、基因工程、免疫研究、組織再生等領(lǐng)域。

圖：類(lèi)器官的應(yīng)用方向[2]

類(lèi)器官主要由成體干細(xì)胞或腫瘤樣本在適宜的培養(yǎng)條件下構(gòu)建。類(lèi)器官的整體培養(yǎng)體系包括組織消化、清洗、處理、培養(yǎng)基配置、基質(zhì)膠與細(xì)胞的混合、培養(yǎng)、觀察等步驟。其中，細(xì)胞懸液與細(xì)胞外基質(zhì)（基質(zhì)膠）混合是關(guān)鍵的步驟之一，為類(lèi)器官提供3D生長(zhǎng)載體。

基質(zhì)膠主要成分由層粘連蛋白，Ⅳ型膠原，硫酸乙酰肝素蛋白聚糖（HSPG）和巢蛋白等組成，還包含生長(zhǎng)因子如TGF-beta、EGF、IGF、FGF、組織纖溶酶原激活物和EHS腫瘤自身含有的其他生長(zhǎng)因子。為組織和細(xì)胞提供支撐、抗拉強(qiáng)度和支架支撐等。翌圣生物開(kāi)發(fā)生產(chǎn)的CeturegelTM基質(zhì)膠不含LDEV（乳酸脫氫酶增高病毒），超低內(nèi)毒素含量，并全部經(jīng)過(guò)支原體檢測(cè)保證無(wú)支原體污染，包括基本濃度、高濃度、低生長(zhǎng)因子等不同類(lèi)型基質(zhì)膠。

Ceturegel™基質(zhì)膠

應(yīng)用方向

產(chǎn)品特點(diǎn)

小鼠小腸類(lèi)器官構(gòu)建

實(shí)驗(yàn)步驟

1. 樣本制備：小鼠斷頸處死，表面噴灑酒精殺菌。在無(wú)菌環(huán)境下截取出近胃端處3~15cm腸組織，用鑷子小心去除腸道外部的腸系膜、脂肪，放入4℃預(yù)冷的含1%雙抗的DPBS溶液中。

2. 樣本清洗：使用注射器沖洗腸道2-3次，用手術(shù)剪將腸管小心剪開(kāi)，腸腔面朝上，手使用手術(shù)刀片輕輕刮去腸腔表面腸絨毛，待腸絨毛被刮凈后（呈現(xiàn)組織透明），將腸組織置于新的含 DPBS 的培養(yǎng)皿中清洗2~3次。

3. 樣本初處理：將清洗后的小腸組織剪碎至2mm寬大小塊狀體，順勢(shì)轉(zhuǎn)移至新的50ml離心管中，用DPBS輕柔清洗3-5次，除去腸絨毛細(xì)胞和漂浮脂肪組織。

4. 樣本消化：在清洗好的小腸碎片組織加入10-15ml含有3-5mM EDTA 的預(yù)冷 DPBS 中消化，4℃孵育 30min左右，期間每10min輕搖一次離心管。

5. 消化完成后，棄去EDTA消化液上清，用新的DPBS緩沖液將組織輕柔漂洗2~3次以去除剩余的EDTA。

6. 在小腸組織碎片中加入10~15ml預(yù)冷的含0.1%BSA的DPBS，反復(fù)吹打、重懸組織碎片，使隱窩與基底層分離，然后取少許懸液鏡檢，當(dāng)看有大量隱窩樣結(jié)構(gòu)后，停止吹打，并對(duì)吹打后的組織懸液使用70μm濾網(wǎng)過(guò)濾并收集穿過(guò)濾網(wǎng)的組織懸液。

7. 重復(fù)步驟5-6兩次，1500rpm、4℃離心 3min。

8. 混合物形成：用Ceturegel™基質(zhì)膠重懸隱窩組織沉淀，每10μL基質(zhì)膠懸液包含200~600個(gè)隱窩，重懸后混合液置于冰上，盡快操作以避免基質(zhì)膠形成凝膠。

注意：基質(zhì)膠稀釋比例≥50%以保證培養(yǎng)過(guò)程中Ceturegel™基質(zhì)膠結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性。

9. 將混合懸液種植于24孔板底部正中央，每孔30~50μL左右，避免懸液接觸孔板側(cè)壁。

10. 將種植后的培養(yǎng)板至于37℃二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱中，孵育30min左右待基質(zhì)膠凝固。

11. 待Ceturegel™基質(zhì)膠完全凝固后，沿壁緩慢加入已配制好的腸類(lèi)器官培養(yǎng)基，每孔 800μL/孔。

12. 將 24 孔板置于37℃二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每3天更換一次新鮮培養(yǎng)基并監(jiān)測(cè)類(lèi)器官生長(zhǎng)狀態(tài)，一般小鼠小腸類(lèi)器官在5~7天內(nèi)形成。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果

Day0

Day3

Day5

Day7

圖：小鼠小腸類(lèi)器官體外培養(yǎng)結(jié)果圖

FAQ

1.消化組織選擇什么消化液，消化時(shí)長(zhǎng)是多少？

組織的消化液可以選用EDTA或膠原酶，如果消化空腔性器官使用EDTA適合，如小腸和胃；膠原酶有不同類(lèi)型，消化的組織類(lèi)型比較廣泛，可以搭配DNA酶一起。不同組織消化時(shí)間差異比較大，從十幾分鐘到數(shù)時(shí)小時(shí)。

2.基質(zhì)膠的操作要注意哪些事項(xiàng)？

所有操作需在無(wú)菌環(huán)境下進(jìn)行，應(yīng)使用預(yù)冷的移液器以保證基質(zhì)膠呈勻漿狀。

3.基質(zhì)膠的如何分裝凍存使用？

可將凍融后的Ceturegel™基質(zhì)膠分裝在多個(gè)小管，所有分裝均需用預(yù)冷的凍存管，迅速冷凍并保存，避免多次

4.不同孔板培養(yǎng)類(lèi)器官培養(yǎng)所需的基質(zhì)膠和培養(yǎng)基體積?

培養(yǎng)類(lèi)器官常用的是24孔板培養(yǎng)，按50μl/孔形成膠滴，再加入500~800μl培養(yǎng)基覆蓋膠滴；96孔板按10μl/孔形成膠滴，再加入200μl培養(yǎng)基覆蓋膠滴；6孔板每孔可以種植多個(gè)50μl膠滴，加入2~3ml培養(yǎng)基覆蓋膠滴。

相關(guān)產(chǎn)品

類(lèi)型	貨號(hào)	產(chǎn)品名稱(chēng)	應(yīng)用方向
即用型 3-6 mg/ml	40182ES	Ceturegel® Matrix Ready-to-use，LDEV-Free基質(zhì)膠	適應(yīng)于細(xì)胞培養(yǎng)、貼壁、侵襲和遷移實(shí)驗(yàn)以及細(xì)胞分化等研究
基本濃度 8-12 mg/ml	40183ES	Ceturegel® Matrix LDEV-Free基質(zhì)膠	適應(yīng)于2D和3D培養(yǎng)、侵襲和遷移實(shí)驗(yàn)，也可以用于體內(nèi)成瘤實(shí)驗(yàn)
基本濃度 8-12 mg/ml	40184ES	Ceturegel® Matrix Phenol Red-Free，LDEV-Free 基質(zhì)膠	主要應(yīng)用于需要顏色檢測(cè)如熒光檢測(cè)實(shí)驗(yàn)等
高濃度 ≥18mg/ml	40187ES	Ceturegel® Matrix High Concentration，LDEV-Free 基質(zhì)膠	主要應(yīng)用于如血管生成、凝膠栓塞和體內(nèi)成瘤實(shí)驗(yàn)（對(duì)于血管生成建議基質(zhì)膠終濃度要≥10mg/ml）
	40189ES	Ceturegel® Matrix High Concentration，GFR，LDEV-Free 基質(zhì)膠
	40188ES	Ceturegel® Matrix High Concentration，Phenol Red-Free，LDEV-Free 基質(zhì)膠
低生長(zhǎng)因子	40185ES	Ceturegel® Matrix GFR，LDEV-Free 基質(zhì)膠	主要是排除生長(zhǎng)因子對(duì)實(shí)驗(yàn)的干擾。應(yīng)用于與生長(zhǎng)因子、信號(hào)通路等相關(guān)研究。無(wú)酚紅的也用來(lái)做類(lèi)器官培養(yǎng)
低生長(zhǎng)因子	40186ES	Ceturegel® Matrix GFR，Phenol Red-Free，LDEV-Free 基質(zhì)膠
干細(xì)胞用	40190ES	Ceturegel® Matrix hESC-Qualified，LDEV-Free 基質(zhì)膠	主要用于如hESC，iPSC等干細(xì)胞培養(yǎng)
類(lèi)器官用	40191ES	Ceturegel® Matrix for Organoid culture，Phenol Red-Free，LDEV-Free 基質(zhì)膠	類(lèi)器官培養(yǎng)專(zhuān)用基質(zhì)膠
鼠尾膠原	40125ES	Collagen, Type I , from rat tail 鼠尾膠原蛋白I（大鼠源）	侵襲和遷移。培養(yǎng)或分化研究
鼠尾膠原	40136ES	Cebrary® Collagen, Type I , from mouse tail 鼠尾膠原蛋白I型（小鼠源）	侵襲和遷移。培養(yǎng)或分化研究

[1] http://www.chinazx.org.cn/i.php?id=3398

[2] CorrÃ², Claudia; Novellasdemunt, Laura; Li, Vivian S.W. (2020). A brief history of organoids. American Journal of Physiology-Cell Physiology, ajpcell.00120.2020.

400-6111-883